解剖されたインプラント組織の免疫機能解析のための高次元フローサイトメトリー
Summary
解剖されたインプラントからの細胞の単離とフローサイトメトリーによる特性評価は、インプラントに対する免疫応答のパターンの理解に大きく貢献します。この論文では、解剖したインプラントから細胞を単離し、フローサイトメトリー解析のために染色するための正確な方法について説明します。
Abstract
実験室で培養した組織または医療機器を個人に埋め込むことの成功は、レシピエント宿主の免疫応答の影響を受けます。インプラントを異物と見なすと、敵対的で調節不全の免疫応答はインプラントの拒絶反応につながる可能性がありますが、調節された反応とホメオスタシスの回復はインプラントの受容につながる可能性があります。 in vivo または ex vivo 環境で解剖されたインプラントの微小環境を分析することは、免疫応答のパターンを理解するのに役立ち、最終的には新世代の生体材料の開発に役立ちます。フローサイトメトリーは、細胞表面マーカーに基づいて免疫細胞とそのサブセットを特徴付けるためのよく知られた手法です。このレビューでは、解剖されたインプラント組織から均一な細胞懸濁液を単離するための、手動ダイシング、酵素消化、およびセルストレーナーによるろ過に基づくプロトコルについて説明します。さらに、マルチカラーフローサイトメトリー染色プロトコルと、フローサイトメトリーによってこれらの単離細胞を特徴付けおよび定量するためのサイトメーターの初期設定の手順について説明しました。
Introduction
医学分野の進歩により、損傷した組織の機能や再成長をサポートするために、埋め込まれた材料が頻繁に使用されるようになりました1,2。これらには、ペースメーカー、再建美容インプラント、骨折固定に使用される整形外科用プレートなどのデバイスが含まれます3,4。しかし、これらのインプラントを製造するために使用される材料とそれらが埋め込まれる場所は、これらのインプラントの成功を決定する上で重要な役割を果たします5,6,7。異物として、これらのインプラントは宿主から免疫応答を引き起こし、拒絶反応または耐性につながる可能性があります8。この要因により、生体材料研究は、移植後に望ましい免疫応答を引き付けることができる材料を生成するように推進されています9,10,11,12。
免疫応答は、損傷した組織または臓器を交換するために実験室で生体材料骨格(足場)の周りに組織または臓器を成長させる再生医療の分野で不可欠な要件です13,14,15,16。再生医療では、細胞、シグナル、足場を使用して欠損または損傷した組織を補うことが目標であり、それぞれが免疫応答によって大きく調節される可能性がある17。さらに、免疫応答の欠如が望まれる場合でも、望まれるのは、調節プロファイルの存在ではなく、免疫活性の欠如であることは非常にまれである18。フローサイトメトリーなどの技術は、インプラントデバイスのコーティングや組織工学のための足場の開発に使用されるさまざまな生体材料に対する免疫応答のパターンを特徴付ける上で重要な役割を果たすことができる19。
この情報は、最終的に、免疫系に十分に耐えられるインプラント用の生体材料の開発や、組織工学において建設的な役割を果たすことができる足場の開発に役立ちます。フローサイトメトリーによる分析用のサンプルを適切に調製することは、蛍光活性化細胞選別による免疫特性評価の不正確な結果を回避するための重要なステップです20,21。したがって、このレビューでは、足場組織からの細胞の単離、細胞懸濁液の染色、およびフローサイトメトリーによる分析に利用できる詳細な方法論を提示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このレビューでは、生体材料インプラントから細胞を単離し、均一な細胞懸濁液を得るための詳細な方法論について述べる。さらに、マルチカラーフローサイトメトリー用の細胞懸濁液を染色するための詳細なプロトコルと、最適な結果を得るためにフローサイトメーターを構成するための手順が提供されています。細胞単離法には複数のステップがあり、多くの場合、手動の組織解剖とそ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究の一部は、国立医用画像・生物工学研究所を含むNIHの学内研究プログラムによって支援されました。 免責事項:NIH、その役員、および従業員は、いかなる会社、製品、またはサービスも推奨または推奨しません。
Materials
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
Riferimenti
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