Flowcytometrie met hoge dimensionaliteit voor analyse van de immuunfunctie van ontlede implantaatweefsels
Summary
Isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun karakterisering door middel van flowcytometrie kan aanzienlijk bijdragen aan het begrijpen van het patroon van immuunrespons tegen implantaten. Dit artikel beschrijft een nauwkeurige methode voor de isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun kleuring voor flowcytometrische analyse.
Abstract
Het succes van het implanteren van in het laboratorium gekweekt weefsel of een medisch hulpmiddel bij een persoon is afhankelijk van de immuunrespons van de ontvangende gastheer. Als een implantaat als een vreemd lichaam wordt beschouwd, kan een vijandige en ontregelde immuunrespons leiden tot de afstoting van het implantaat, terwijl een gereguleerde respons en het herwinnen van homeostase kan leiden tot de acceptatie ervan. Het analyseren van de micro-omgevingen van implantaten die zijn ontleed onder di vivo of ex vivo settings kan helpen bij het begrijpen van het patroon van immuunrespons, wat uiteindelijk kan helpen bij het ontwikkelen van nieuwe generaties biomaterialen. Flowcytometrie is een bekende techniek voor het karakteriseren van immuuncellen en hun subsets op basis van hun markers op het celoppervlak. Deze review beschrijft een protocol gebaseerd op handmatige dobbelstenen, enzymatische vertering en filtratie door een celzeef voor de isolatie van uniforme celsuspensies uit ontleed implantaatweefsel. Verder is een meerkleurig flowcytometriekleuringsprotocol uitgelegd, samen met stappen voor initiële cytometerinstellingen om deze geïsoleerde cellen te karakteriseren en te kwantificeren door middel van flowcytometrie.
Introduction
Vooruitgang op het gebied van de geneeskunde heeft geleid tot het veelvuldig gebruik van geïmplanteerde materialen ter ondersteuning van de functie of hergroei van beschadigd weefsel 1,2. Deze omvatten apparaten zoals pacemakers, reconstructieve cosmetische implantaten en orthopedische platen die worden gebruikt voor fixatie van botbreuken 3,4. De materialen die worden gebruikt om deze implantaten te maken en de locaties waar ze worden geïmplanteerd, spelen echter een belangrijke rol bij het bepalen van het succes van deze implantaten 5,6,7. Als vreemde lichamen kunnen deze implantaten een immuunrespons van de gastheer opwekken die kan leiden tot afstoting of tolerantie8. Deze factor heeft biomateriaalonderzoek ertoe aangezet materialen te genereren die de gewenste immuunrespons kunnen aantrekken na implantatie 9,10,11,12.
De immuunrespons is een essentiële vereiste op het gebied van regeneratieve geneeskunde, waarbij in een laboratorium een weefsel of een orgaan wordt gekweekt rond een biomateriaalskelet (steiger) voor de vervanging van een beschadigd weefsel of orgaan13,14,15,16. In de regeneratieve geneeskunde is het doel om ontbrekend of beschadigd weefsel te vervangen door het gebruik van cellen, signalen en steigers, die elk sterk kunnen worden gemoduleerd door immuunresponsen17. Bovendien, zelfs wanneer een gebrek aan immuunrespons gewenst is, is het zeer zelden een afwezigheid van immuunactiviteit in plaats van de aanwezigheid van een regulerend profiel dat gewenst is18. Technieken zoals flowcytometrie kunnen een belangrijke rol spelen bij het karakteriseren van het patroon van immuunrespons op verschillende biomaterialen die worden gebruikt voor het coaten van implantaten of voor het ontwikkelen van steigers voor weefselmanipulatie19.
Deze informatie zal op zijn beurt uiteindelijk helpen bij het ontwikkelen van biomaterialen voor implantaten die goed kunnen worden verdragen door het immuunsysteem of bij het ontwikkelen van steigers die een constructieve rol kunnen spelen bij tissue engineering. Een goede voorbereiding van monsters voor analyse door middel van flowcytometrie is een belangrijke stap om onnauwkeurige resultaten bij immuunkarakterisering via fluorescentie-geactiveerde celsorteringte voorkomen 20,21. Daarom presenteert deze review een gedetailleerde methodologie die kan worden gebruikt voor de isolatie van cellen uit steigerweefsel, het kleuren van de celsuspensie en analyse door middel van flowcytometrie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze review beschrijft een gedetailleerde methodologie voor het isoleren van cellen uit biomateriaalimplantaten om een uniforme celsuspensie te verkrijgen. Daarnaast is er een gedetailleerd protocol voor het kleuren van de celsuspensie voor meerkleurige flowcytometrie, samen met de stappen voor het configureren van een flowcytometer voor optimale resultaten. Celisolatiemethoden kunnen meerdere stappen omvatten, waarbij vaak gebruik wordt gemaakt van handmatige weefseldissectie gevolgd door enzymatische vertering met prot…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het Intramural Research Program van de NIH, waaronder het National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering. Disclaimer: De NIH, haar functionarissen en werknemers bevelen geen enkel bedrijf, product of dienst aan of onderschrijven het.
Materials
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
Riferimenti
- Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
- Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules. Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).
- Rolfe, B., et al., Eberli, D., et al. The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering. Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. , (2011).
- Erdem, S., Gür, M., Kaman, M. O. Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions. Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).
- Kang, C. -. W., Fang, F. -. Z. State of the art of bioimplants manufacturing: part I. Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).
- Sadtler, K., et al. Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds. Biomaterials. 192, 405-415 (2019).
- Sadtler, K., et al. Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040 (2016).
- Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. Materials engineering for immunomodulation. Nature. 462 (7272), 449-460 (2009).
- Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling. Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).
- Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
- Zhang, L., et al. Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction. Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).
- Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction. Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).
- Tan, H., Marra, K. G. Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications. Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).
- Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials. Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).
- Sadtler, K., et al. Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells. Science. 352 (6283), 366-370 (2016).
- Gower, R. M., et al. Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression. Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).
- Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).
- Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A. Engineering antigen-specific immunological tolerance. Current Opinion Immunology. 35, 80-88 (2015).
- Sadtler, K., Elisseeff, J. H. Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials. Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Shapiro, H. M. . Practical Flow Cytometry. , (2003).
- Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2013).
- Wolf, M. T., et al. A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy. Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).
- Kahng, J., et al. Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts. Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).
- Sionov, R. V., et al. Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties. Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).
- Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
- Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).
