विच्छेदित प्रत्यारोपण ऊतकों के प्रतिरक्षा समारोह विश्लेषण के लिए उच्च-आयामीता प्रवाह साइटोमेट्री
Summary
विच्छेदित प्रत्यारोपण से कोशिकाओं का अलगाव और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा उनके लक्षण वर्णन प्रत्यारोपण के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के पैटर्न को समझने में महत्वपूर्ण योगदान दे सकते हैं। यह पेपर विच्छेदित प्रत्यारोपण से कोशिकाओं के अलगाव और प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए उनके धुंधला होने के लिए एक सटीक विधि का वर्णन करता है।
Abstract
किसी व्यक्ति में प्रयोगशाला में विकसित ऊतक या चिकित्सा उपकरण को प्रत्यारोपित करने की सफलता प्राप्तकर्ता मेजबान की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अधीन है। एक इम्प्लांट को एक विदेशी शरीर के रूप में मानते हुए, एक शत्रुतापूर्ण और अनियमित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप प्रत्यारोपण की अस्वीकृति हो सकती है, जबकि एक विनियमित प्रतिक्रिया और होमियोस्टैसिस को पुनः प्राप्त करने से इसकी स्वीकृति हो सकती है। विवो या एक्स विवो सेटिंग्स में विच्छेदित प्रत्यारोपण के माइक्रोएन्वायरमेंट का विश्लेषण करने से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के पैटर्न को समझने में मदद मिल सकती है, जो अंततः बायोमटेरियल्स की नई पीढ़ियों को विकसित करने में मदद कर सकती है। फ्लो साइटोमेट्री प्रतिरक्षा कोशिकाओं और उनके सेल सतह मार्करों के आधार पर उनके उप-समूहों को चिह्नित करने के लिए एक प्रसिद्ध तकनीक है। यह समीक्षा विच्छेदित प्रत्यारोपण ऊतक से समान सेल निलंबन के अलगाव के लिए सेल छन्नी के माध्यम से मैनुअल डाइकिंग, एंजाइमेटिक पाचन और निस्पंदन पर आधारित एक प्रोटोकॉल का वर्णन करती है। इसके अलावा, फ्लो साइटोमेट्री द्वारा इन पृथक कोशिकाओं को चिह्नित करने और निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक साइटोमीटर सेटिंग्स के चरणों के साथ-साथ एक मल्टीकलर फ्लो साइटोमेट्री स्टेनिंग प्रोटोकॉल को समझाया गया है।
Introduction
चिकित्सा के क्षेत्र में प्रगति ने क्षतिग्रस्त ऊतक 1,2 के कार्य या पुन: विकास का समर्थन करने के लिए प्रत्यारोपित सामग्रियों के लगातार उपयोग को जन्म दिया है। इनमें पेसमेकर, पुनर्निर्माण कॉस्मेटिक प्रत्यारोपण और हड्डी फ्रैक्चर निर्धारण 3,4 के लिए उपयोग किए जाने वाले आर्थोपेडिक प्लेट जैसे उपकरण शामिल हैं। हालांकि, इन प्रत्यारोपणों को बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्री और जिन स्थानों में उन्हें प्रत्यारोपित किया जाता है, वेइन प्रत्यारोपणों की सफलता को निर्धारित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। विदेशी निकायों के रूप में, ये प्रत्यारोपण मेजबान से एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न कर सकते हैं जो या तो अस्वीकृतिया सहिष्णुता का कारण बन सकता है। इस कारक ने बायोमटेरियल अनुसंधान को उन सामग्रियों को उत्पन्न करने के लिए प्रेरित किया है जो आरोपण 9,10,11,12 के बाद वांछित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को आकर्षित कर सकते हैं।
पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया एक आवश्यक आवश्यकता है, जहां क्षतिग्रस्त ऊतक या अंग 13,14,15,16 के प्रतिस्थापन के लिए एक प्रयोगशाला में एक बायोमटेरियल कंकाल (मचान) के आसपास एक ऊतक या एक अंग उगाया जाता है। पुनर्योजी चिकित्सा में, लक्ष्य कोशिकाओं, संकेतों और मचानों के उपयोग के माध्यम से लापता या क्षतिग्रस्त ऊतक को प्रतिस्थापित करना है, जिनमें से प्रत्येक कोप्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं द्वारा बहुत संशोधित किया जा सकता है। इसके अलावा, यहां तक कि जब प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की कमी वांछित होती है, तो यह एक नियामक प्रोफ़ाइल की उपस्थिति के बजाय प्रतिरक्षा गतिविधि की अनुपस्थिति बहुत कम होती है जो वांछितहै। फ्लो साइटोमेट्री जैसी तकनीकें कोटिंग इम्प्लांट उपकरणों के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न बायोमैटेरियल्स के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के पैटर्न को चिह्नित करने याऊतक इंजीनियरिंग के लिए मचान विकसित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती हैं।
यह जानकारी, बदले में, अंततः प्रत्यारोपण के लिए बायोमैटेरियल्स विकसित करने में मदद करेगी जिसे प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा अच्छी तरह से सहन किया जा सकता है या मचानों को विकसित करने में जो ऊतक इंजीनियरिंग में रचनात्मक भूमिका निभा सकते हैं। फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण के लिए नमूनों की उचित तैयारी प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग20,21 के माध्यम से प्रतिरक्षा लक्षण वर्णन में गलत परिणामों से बचने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। इसलिए, यह समीक्षा एक विस्तृत पद्धति प्रस्तुत करती है जिसका उपयोग मचान ऊतक से कोशिकाओं के अलगाव, सेल निलंबन को धुंधला करने और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह समीक्षा एक समान सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए बायोमटेरियल प्रत्यारोपण से कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक विस्तृत पद्धति का वर्णन करती है। इसके अलावा, इष्टतम परिणामों के लिए फ्लो साइटोमीटर को कॉन्फ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को एनआईएच के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था, जिसमें नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बायोमेडिकल इमेजिंग एंड बायोइंजीनियरिंग भी शामिल है। अस्वीकरण: एनआईएच, उसके अधिकारी और कर्मचारी किसी भी कंपनी, उत्पाद या सेवा की सिफारिश या समर्थन नहीं करते हैं।
Materials
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
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