Citometría de flujo de alta dimensionalidad para el análisis de la función inmunitaria de tejidos de implantes disecados
Summary
El aislamiento de células de implantes disecados y su caracterización por citometría de flujo puede contribuir significativamente a la comprensión del patrón de respuesta inmune contra implantes. En este trabajo se describe un método preciso para el aislamiento de células de implantes disecados y su tinción para el análisis citométrico de flujo.
Abstract
El éxito de implantar tejido cultivado en laboratorio o un dispositivo médico en un individuo está sujeto a la respuesta inmunitaria del huésped receptor. Al considerar un implante como un cuerpo extraño, una respuesta inmune hostil y desregulada puede resultar en el rechazo del implante, mientras que una respuesta regulada y la recuperación de la homeostasis pueden conducir a su aceptación. El análisis de los microambientes de los implantes diseccionados en entornos di vivo o ex vivo puede ayudar a comprender el patrón de la respuesta inmunitaria, lo que en última instancia puede ayudar a desarrollar nuevas generaciones de biomateriales. La citometría de flujo es una técnica bien conocida para caracterizar las células inmunitarias y sus subconjuntos en función de sus marcadores de superficie celular. Esta revisión describe un protocolo basado en el corte manual en cubitos, la digestión enzimática y la filtración a través de un filtro celular para el aislamiento de suspensiones celulares uniformes del tejido del implante disecado. Además, se ha explicado un protocolo de tinción por citometría de flujo multicolor, junto con los pasos para la configuración inicial del citómetro para caracterizar y cuantificar estas células aisladas mediante citometría de flujo.
Introduction
Los avances en el campo de la medicina han llevado al uso frecuente de materiales implantados para apoyar la función o el recrecimiento del tejido dañado 1,2. Estos incluyen dispositivos como marcapasos, implantes cosméticos reconstructivos y placas ortopédicas utilizadas para la fijación de fracturas óseas 3,4. Sin embargo, los materiales utilizados para fabricar estos implantes y los lugares en los que se implantan juegan un papel importante en la determinación del éxito de estos implantes 5,6,7. Como cuerpos extraños, estos implantes pueden generar una respuesta inmune del huésped que puede conducir al rechazo o a la tolerancia8. Este factor ha impulsado la investigación de biomateriales para generar materiales que puedan atraer la respuesta inmune deseada después de la implantación 9,10,11,12.
La respuesta inmune es un requisito esencial en el campo de la medicina regenerativa, donde se cultiva un tejido u órgano alrededor de un esqueleto de biomaterial (andamio) en un laboratorio para el reemplazo de un tejido u órgano dañado13,14,15,16. En medicina regenerativa, el objetivo es reemplazar el tejido faltante o dañado mediante el uso de células, señales y andamios, cada uno de los cuales puede ser modulado en gran medida por las respuestas inmunitarias17. Además, incluso cuando se desea una falta de respuesta inmunitaria, es muy raro que lo que se desee sea una ausencia de actividad inmunitaria en lugar de la presencia de un perfil regulador18. Técnicas como la citometría de flujo pueden desempeñar un papel importante en la caracterización del patrón de respuesta inmunitaria a diversos biomateriales utilizados para el recubrimiento de dispositivos de implantes o para el desarrollo de andamios para la ingeniería de tejidos19.
Esta información, a su vez, ayudará en última instancia en el desarrollo de biomateriales para implantes que puedan ser bien tolerados por el sistema inmunitario o en el desarrollo de andamios que puedan desempeñar un papel constructivo en la ingeniería de tejidos. La preparación adecuada de las muestras para su análisis por citometría de flujo es un paso importante para evitar resultados inexactos en la caracterización inmune mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia20,21. Por lo tanto, esta revisión presenta una metodología detallada que se puede utilizar para el aislamiento de células del tejido de andamio, la tinción de la suspensión celular y el análisis por citometría de flujo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta revisión describe una metodología detallada para aislar células de implantes de biomateriales para obtener una suspensión celular uniforme. Además, se ha proporcionado un protocolo detallado para teñir la suspensión celular para la citometría de flujo multicolor, junto con los pasos para configurar un citómetro de flujo para obtener resultados óptimos. Los métodos de aislamiento celular pueden implicar varios pasos, a menudo utilizando la disección manual de tejidos seguida de la digestión enzimática c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada en parte por el Programa de Investigación Intramuros de los NIH, incluido el Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería. Descargo de responsabilidad: Los NIH, sus funcionarios y empleados no recomiendan ni respaldan ninguna empresa, producto o servicio.
Materials
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
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