En protokol til immunohistokemi og RNA in situ-distribution inden for tidligt drosophila-embryo

Summary

Her beskriver vi en protokol til påvisning og lokalisering af Drosophila embryoprotein og RNA fra indsamling til præindlejring og indlejring, immunstaining og mRNA in situ hybridisering.

Abstract

Calciuminduceret calciumfrigivelsessignalering (CICR) spiller en kritisk rolle i mange biologiske processer. Hver cellulær aktivitet fra celleproliferation og apoptose, udvikling og aldring til neuronal synaptisk plasticitet og regenerering har været forbundet med ryanodinreceptorer (RyR’er). På trods af vigtigheden af calciumsignalering er den nøjagtige mekanisme for dens funktion i tidlig udvikling uklar. Som en organisme med en kort svangerskabsperiode er embryonerne af Drosophila melanogaster primære forsøgspersoner til undersøgelse af distribution og lokalisering af CICR-associerede proteiner og deres regulatorer under udvikling. På grund af deres lipidrige embryoner og chitinrige chorion er deres anvendelighed imidlertid begrænset af vanskeligheden ved at montere embryoner på glasoverflader. I dette arbejde introducerer vi en praktisk protokol, der signifikant forbedrer fastgørelsen af Drosophila embryo på dias og detaljer metoder til vellykket histokemi, immunhistokemi og in situ hybridisering . Krom alun gelatine diasbelægningsmetode og embryo pre-embedding metode dramatisk øger udbyttet i studiet af Drosophila embryo protein og RNA ekspression. For at demonstrere denne tilgang studerede vi DmFKBP12 / Calstabin, en velkendt regulator af RyR under tidlig embryonal udvikling af Drosophila melanogaster. Vi identificerede DmFKBP12 så tidligt som det syncytiale blastodermstadium og rapporterer det dynamiske ekspressionsmønster af DmFKBP12 under udvikling: først som et jævnt fordelt protein i syncytial blastoderm, derefter foreløbigt lokaliseret til kælderlaget af cortex under cellulær blastoderm, før det fordeles i den primitive neuronale og fordøjelsesarkitektur under tre-ædelstenslagsfasen i tidlig gastrulation. Denne fordeling kan forklare den kritiske rolle, RyR spiller i de vitale organsystemer, der stammer fra disse lag: den suboøsofageale og supraesophageale ganglion, ventrale nervesystem og muskuloskeletale system.

Introduction

Calciuminduceret calciumfrigivelsessignalering (CICR) spiller en kritisk rolle i mange biologiske processer, såsom skelet/glat muskel og hjertevaskulær funktion, celleproliferation og apoptose, udvikling, aldring, neuronal synaptisk plasticitet og regenerering1,2,3,4,5,6 . Ryanodinreceptorer (RyR’er) og inositol 1,4,5-trisphosphatreceptorer (IP3R’er) er vigtige aktører i calciumsignalvejen, der styres af deres regulatorer proteinkinase A (PKA), ^Ca2+/calmodulinafhængig proteinkinase II (CaMKII), FK506-bindende proteiner (FKBP’er), calsequestrin (CSQ), triadin og junctin1,2,3,4,5,6 . Unormal menneskelig ekspression og mutationer i disse proteiner kan føre til patologisk fysiologi såsom arytmier7 og onkogen ^{proliferation8,9}.

FKBP’er regulerer calciumfrigivelsen fra den endoplasmatiske retikulære (ER) af RyRs. Denne proces er afgørende for sammentrækningsmekanismen og dermed ansvarlig for al mekanisk bevægelse genereret af myosin-actinkontraktion gennem calciuminduceret calciumfrigivelse sammen med embryonale ^RyRs1,2. I musemodeller er manglen på RyR2 og dens regulator FKBP12/Calstabin altid dødelig, enten under embryonal udvikling eller i den tidlige postnatale periode10,11,12. FKBP12/Calstabin knockout-mus udviser kritiske hjertefejl med uregelmæssig excitationskontraktionskobling (EC) og cerebralt ødem under embryonal udvikling. Dette indikerer, at FKBP12/Calstabin spiller en væsentlig rolle i reguleringen af RyR2-kanalekspression, hvilket er vigtigt både for hjerte- og cerebral ^udvikling10.

RyR-udførte calciumgnister blev oprindeligt opdaget i zygotdannelsesfasen af befrugtede Medaka-æg13,14. Der er imidlertid kun foretaget få undersøgelser af calciumsignaleringens funktion i den tidlige embryonale udvikling. I Drosophila melanogaster giver resultater opnået fra DmFKBP12 S107-mutanter stærke beviser, der understøtter betydningen af dette gen for larveudvikling og en sund levetid, hvilket tilskrives dets funktion mod oxidativ ^stress15,16. For nylig identificerede vi den dynamiske lokalisering af FKBP12/Calstabin-protein og messenger-RNA under den tidlige Udvikling af Drosophila melanogaster17. Ved hjælp af de tilgange, der er beskrevet i denne metode, var vi i stand til at spore ekspressionen af FKBP12 / Calstabin i D. melanogaster under syncytial blastoderm (0-2 timer), cellulær blastoderm (2-3 timer), tidlig gastrula (3-12 timer) og sen gastrula (12-24 timer). I dette papir præsenterer vi de detaljerede protokoller for hver tilgang i den foregående undersøgelse, herunder præ-embryoindlejring til klassisk paraffinsektionering, præ-coating diasbehandling til embryonale sektioner, histo-kemi farvning og immunfarvning og mRNA in-situ hybridisering til identifikation af genekspression.

Protocol

1. Tilberedning af druesaft agar plader Tilsæt 5 g agar og 5 g saccharose til 150 ml destilleret vand. Kog det ved hjælp af en mikrobølgeovn, indtil agar og saccharose er fuldt opløst. Bland 50 ml 100% druesaft og opløsningen sammen. Tilsæt 1 ml 100% propionsyre for at gøre den endelige koncentration til 0,5% propionsyre. Hæld 25 ml af den tilberedte opløsning i hver plade. Når agaren er størknet, opbevares mediet i 4 °C. 2. Belægni…

Representative Results

Tallene beskriver protokoller, der bruges til at overvinde udfordringen med at fastgøre høje lipid- og chitinholdige chorion Drosophila-embryoner (tabel 1) til glasglideoverfladen til undersøgelse og eksperimentering. Ved hjælp af krommamelatine-diasbelægningsmetoden vist i figur 1 forbedrede vi fastgørelsen af Drosophila-embryoner på overfladen af dias, mens embryo-præindlejringsmetoden vist i figur 2 muliggør effekti…

Discussion

RyRs og IP3Rs medieret calciumsignalering er en grundlæggende vej i mange fysiologiske og patologiske processer hos både hvirveldyr og hvirvelløse dyr1,2,3,4. Hos mennesker fører punktmutationer, såsom CPVT-associeret R4496C-mutation, i RyR2-genet til calciumlækage fra det sarkoplasmatiske retikulum af kardiomyocyt, hvilket resulterer i hjertedysfunktion. Disse mutationer præsenterer som…

Materials

-20°C Refrigerator	Meiling Biology &Medical	DW-YL270	Used for regent storage
-80°C Ultra low temperature refrigerator	Thermo	Forma 90 Series	Used for regent storage
Agar	Sigma-Aldrich	WXBB6360V	Preparation of grape juice agar plates
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments	Roche	11093274910	For the detection of digoxigenin-labeled compound
Biochemical incubator	Shanghai Bluepard Instruments	LRH-250	In-situ Hybridization
Bouin's solution	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	69945460	Drosophila Embryo Embedding
Centrifuge	Eppendorf	540BH07808	In-situ Hybridization
Centrifuge tube	Denville	C-2170	Drosophila Embryo Collection
Chrome Alum	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10001018	Coating Slides
Constant temperature water bath	Jintan Henfeng Instruments	KW-1000DC	Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Dako REAL EnVision Detection System	Dako	K5007	In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining.
DEPC	Sigma-Aldrich	D5758	In-situ Hybridization
DIG RNA Labeling Kit	Roche	11093274910	RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase
Drosophila melanogaster	Bloomington Stock Center	BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664	The stocks of Drosophila melanogaster mutant
Electric blast drying oven	Tianjin Taiste Instruments	101-0AB	For coating slides and paraffin embedding
Eosin	Sigma-Aldrich	230251	Hematoxylin-Eosin Staining
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	100092680	Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Gelatin	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10010328	Coating Slides
Gold chloride	Sigma-Aldrich	379948	Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3136	Hematoxylin-Eosin Staining
High Pure PCR Product Purification Kit	Roche	11732668001	For purification of PCR products
Intelligent constant temperature and humidity box	Ningbo Jiangnan Instruments	HWS	For fly maintenance
LE Agarose	HyAgarose	14190108029	Pre-embedding
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10014108	Drosophila Embryo Collection
Microscope	ZEISS	Observer.A1	Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Microscope Slides	MeVid Labware Manufacturing	P105-2001	Coating Slides
Neutral Gum	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10004160	Hematoxylin-Eosin Staining
N-heptane	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	40026768	Drosophila Embryo Collection
Paraffin slicer	Huahai science instrument	HH-2508III	In-situ Hybridization
Paraffin	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	69019461	Paraffin Embedding
pH/mV Meter	Sartorius	PB-10	For determing the pH value of a solution
Silver nitrate	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10018461	Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Ultrapure water meter	Thermo	AFXI-0501-P	In-situ Hybridization
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10023418	Paraffin Embedding