Qui, descriviamo un protocollo per il rilevamento e la localizzazione della proteina embrionale di Drosophila e dell'RNA dalla raccolta al pre-incorporamento e incorporamento, all'immunocolorazione e all'ibridazione in situ dell'mRNA.
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Articolo metodologico
Un protocollo per l'immunoistochimica e la distribuzione dell'RNA in situ all'interno dell'embrione di drosofila precoce
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La segnalazione del rilascio di calcio indotta dal calcio (CICR) svolge un ruolo fondamentale in molti processi biologici. Ogni attività cellulare dalla proliferazione cellulare e apoptosi, allo sviluppo e all'invecchiamento, alla plasticità sinaptica neuronale e alla rigenerazione è stata associata ai recettori della rianodina (RyRs). Nonostante l'importanza della segnalazione del calcio, l'esatto meccanismo della sua funzione nello sviluppo iniziale non è chiaro. Come organismo con un breve periodo gestazionale, gli embrioni di Drosophila melanogaster sono soggetti di studio primari per studiare la distribuzione e la localizzazione delle proteine associate al CICR e dei loro regolatori durante lo sviluppo. Tuttavia, a causa dei loro embrioni ricchi di lipidi e del coro ricco di chitina, la loro utilità è limitata dalla difficoltà di montare embrioni su superfici di vetro. In questo lavoro, introduciamo un protocollo pratico che migliora significativamente l'attaccamento dell'embrione di Drosophila su vetrini e metodi di dettaglio per il successo dell'istochimica, dell'immunoistochimica e dell'ibridazione in situ . Il metodo di rivestimento del vetrino della gelatina di allume di cromo e il metodo di pre-incorporamento dell'embrione aumentano notevolmente la resa nello studio della proteina embrionale di Drosophila e dell'espressione dell'RNA. Per dimostrare questo approccio, abbiamo studiato DmFKBP12 / Calstabin, un noto regolatore di RyR durante lo sviluppo embrionale precoce di Drosophila melanogaster. Abbiamo identificato DmFKBP12 già nello stadio sinciziale del blastoderma e riportato il modello di espressione dinamica di DmFKBP12 durante lo sviluppo: inizialmente come proteina uniformemente distribuita nel blastoderma sinciziale, quindi localizzando preliminarmente nello strato basale della corteccia durante il blastoderma cellulare, prima di distribuirsi nell'architettura neuronale e digestiva primitiva durante la fase dello strato di tre gemme nella gastrulazione precoce. Questa distribuzione può spiegare il ruolo critico che RyR svolge nei sistemi di organi vitali che hanno origine da questi strati: il ganglio subesofageo e sopraesofageo, il sistema nervoso ventrale e il sistema muscolo-scheletrico.
Introduzione
La segnalazione del rilascio di calcio indotta dal calcio (CICR) svolge un ruolo fondamentale in molti processi biologici, come la funzione scheletrica/muscolare liscia e la funzione vascolare cardiaca, la proliferazione cellulare e l'apoptosi, lo sviluppo, l'invecchiamento, la plasticità sinaptica neuronale e la rigenerazione1,2,3,4,5,6 . I recettori della rianodina (RyRs) e i recettori dell'inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP3R) sono i principali attori nella via di segnalaz....
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Protocollo
1. Preparazione di piatti di agar di succo d'uva
- Aggiungere 5 g di agar e 5 g di saccarosio a 150 ml di acqua distillata. Farlo bollire usando un forno a microonde fino a quando l'agar e il saccarosio sono completamente sciolti. Mescolare 50 ml di succo d'uva al 100% e la soluzione insieme.
- Aggiungere 1 mL di acido propionico al 100% per rendere la concentrazione finale allo 0,5% di acido propionico. Versare 25 ml della soluzione preparata in ogni piastra. Dopo che l'agar si è solidificato, conservare il supporto a 4 °C.
2. Vetrini di rivestimento
- Pretrattare i vetrini co....
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Risultati
Le figure descrivono i protocolli utilizzati per superare la sfida di attaccare embrioni di Drosophila ad alto contenuto di lipidi e chitina (Tabella 1) alla superficie del vetrino per l'esame e la sperimentazione. Utilizzando il metodo di rivestimento dei vetrini di gelatina di allume cromato mostrato nella Figura 1, abbiamo migliorato l'attaccamento degli embrioni di Drosophila sulla superficie dei vetrini, mentre il metodo di pre-incorporamento dell'embr.......
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Discussione
La segnalazione del calcio mediata da RyR e IP3R è una via fondamentale in molti processi fisiologici e patologici di animali vertebrati e invertebrati1,2,3,4. Nell'uomo, le mutazioni puntiformi, come la mutazione R4496C associata a CPVT, nel gene RyR2 portano alla fuoriuscita di calcio dal reticolo sarcoplasmatico dei cardiomiociti, con conseguente disfunzione cardiaca. Queste mutazioni si pre.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (#31771377/ 31571273/31371256), dal Foreign Distinguished Scientist Program del National Department of Education (#MS2014SXSF038), dal National Department of Education Central Universities Research Fund (#GK201301001/201701005/GERP-17-45) e XZ è supportato da Outstanding Doctoral Thesis Fund (#2019TS082 /2019TS079), Key Program of Shaanxi Provincial Education Department (#20JS138), il Natural Science Basic Research Program Youth Project del Dipartimento Provinciale di Scienza e Tecnologia dello Shaanxi (#2020JQ-885).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| -20° C Frigorifero | Meiling Biologia & Medico | DW-YL270 | Utilizzato per lo stoccaggio reggente-80 |
| ° C Frigorifero a bassissima temperatura | Thermo | Forma 90 Series | Utilizzato per la conservazione dei reggenti |
| Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Preparazione di piastre di agar per succo d'uva |
| Anti-Digoxigenina-AP, frammenti Fab Roche | 11093274910 | Per la rilevazione di composti marcati con digossigenina | |
| Incubatore biochimico | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Ibridazione |
| Bouin | Reagente chimico Sinopharm a Pechino | 69945460 | Centrifuga per inclusione di embrioni di Drosophila |
| Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Ibridazione | |
| Provetta per centrifuga | Denville | C-2170 | Raccolta di embrioni di Drosophila |
| Allume di cromo | Sinopharm Reagente chimico presso Pechino | 10001018 | Coating Slides |
| Bagno d'acqua a temperatura costante | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Colorazione ematossilina-eosina, immunoistochimica, ibridazione in situ e colorazione periodica acido-argento metenamina Dako |
| REAL EnVision Detection System | Dako | K5007 | Nella reazione immunoistochimica o nella reazione di ibridazione in situ, si lega all'anticorpo dell'antigene primario e il bersaglio viene marcato mediante colorazione. |
| ibridazione in situ | DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 |
| Roche | 11093274910 | la marcatura dell'RNA con diagoxigenina-UTP mediante trascrizione in vitro con RNA polimerasi SP6 e T7 | |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | Le scorte di Drosophila melanogaster mutant |
| Forno elettrico di essiccazione | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | Per vetrini di rivestimento e inclusione di paraffina |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Colorazione con ematossilina-eosina |
| Reagente chimico Sinopharm a Pechino | 100092680 | Inclusione di paraffina, colorazione ematossilina-eosina, immunoistochimica, ibridazione in situ e colorazione periodica acido-argento metenamina | |
| Gelatina Sinopharm Reagente Chimico a Pechino | 10010328 | Rivestimento Vetrini | |
| Cloruro d'oro | Sigma-Aldrich | 379948 | Periodico Acido-Argento Metenamina Colorazione |
| Ematossilina | Sigma-Aldrich | H3136 | Ematossilina-Eosina Colorazione |
| PCR ad alta purezza Kit di purificazione del prodotto | Roche | 11732668001 | Per la purificazione dei prodotti |
| PCRScatola intelligente per la temperatura e l'umidità costanti | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | Per la manutenzione delle mosche |
| LE Agarosio | HyAgarose | 14190108029 | Pre-inclusione |
| del metanolo | Sinopharm Reagente chimico a Pechino | 10014108 | Microscopio per la raccolta di embrioni di Drosophila |
| ZEISS | Observer.A1 | Colorazione con ematossilina-eosina, immunoistochimica, ibridazione in situ e colorazione periodica acido-argento metenamina | |
| vetrini per microscopio | MeVid Labware Manufacturing | P105-2001 | Vetrini per rivestimento |
| Gomma neutra | Sinopharm a Pechino | 10004160 | Colorazione con ematossilina-eosina |
| N-eptano | Sinopharm Reagente chimico a Pechino | 40026768 | Drosophila Affettatrice |
| per paraffina | Strumento scientifico Huahai | HH-2508III | em>In-situ Reagente |
| ibridazione Paraffina | Sinopharm a Pechino | 69019461 | inclusione in paraffina |
| Sartorius | PB-10 | Per determinare il valore del pH di una soluzione | |
| Nitrato d'argento | Reagente chimico Sinopharm a Pechino | 10018461 | Contatore di acqua ultrapura per colorazione periodica acido-argento metenammina |
| Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Ibridazione | |
| Xilene | Sinopharm Reagente chimico a Pechino | 10023418 | Inclusione di paraffina |
Riferimenti
- Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
- Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
- Fan, J., et al.
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Ristampe e permessi
