초기 초파리 배아 내의 면역조직화학 및 RNA 계내 분포를 위한 프로토콜
Summary
여기에서, 우리는 초파리 배아 단백질 및 RNA의 검출 및 국소화를 위한 프로토콜을 기술한다 수집에서 사전-포베딩 및 포매, 면역염색, 및 mRNA 를 계내 혼성화에 이르게 한다.
Abstract
칼슘 유도 칼슘 방출 신호 (CICR)는 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을합니다. 세포 증식 및 아폽토시스, 발달 및 노화, 뉴런 시냅스 가소성 및 재생에 이르기까지 모든 세포 활성은 Ryanodine 수용체 (RyRs)와 관련이 있습니다. 칼슘 신호 전달의 중요성에도 불구하고, 초기 개발에서 그 기능의 정확한 메커니즘은 불분명하다. 임신 기간이 짧은 유기체로서, 초파리 멜라노가스터의 배아는 발달 중에 CICR 관련 단백질 및 그들의 조절자의 분포 및 국소화를 조사하기위한 주요 연구 대상입니다. 그러나 지질이 풍부한 배아와 키틴이 풍부한 쵸리온으로 인해 유리 표면에 배아를 장착하기가 어려워 유용성이 제한됩니다. 이 연구에서는 초파리 배아를 슬라이드에 부착하는 것을 크게 향상시키는 실용적인 프로토콜과 성공적인 조직 화학, 면역 조직 화학 및 현장 혼성화를위한 세부 방법을 소개합니다. 크롬 명반 젤라틴 슬라이드 코팅 방법 및 배아 사전 임베딩 방법은 초파리 배아 단백질 및 RNA 발현을 연구하는 데 수율을 극적으로 증가시킵니다. 이 접근법을 입증하기 위해, 우리는 초파리 멜라노가스터의 초기 배아 발달 동안 RyR의 잘 알려진 조절자 인 DmFKBP12 / Calstabin을 연구했습니다. 우리는 싱크로나이셜 배반배엽 단계에서 DmFKBP12를 확인하고 개발 중에 DmFKBP12의 동적 발현 패턴을 보고 하였다: 초기에는 세포융합 배반엽에서 고르게 분포된 단백질로서, 그 후 세포 배반배엽 동안 피질의 기저층으로 미리 국소화하고, 초기 위축에서 삼겜층 단계 동안 원시적 뉴런 및 소화 구조에 분배하기 전에. 이 분포는 RyR이 이러한 층에서 유래 한 중요한 장기 시스템에서 중요한 역할을 설명 할 수 있습니다 : 식도 하 및 식도 신경절, 복부 신경계 및 근골격계.
Introduction
칼슘 유도 칼슘 방출 신호전달(CICR)은 골격/평활근 및 심장 혈관 기능, 세포 증식 및 아폽토시스, 발달, 노화, 신경 시냅스 가소성 및 재생과 같은 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다1,2,3,4,5,6 . 리아노딘 수용체 (RyRs) 및 이노시톨 1,4,5-트리스포스페이트 수용체 (IP3Rs)는 그들의 조절인자인 단백질 키나아제 A (PKA), Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 II (CaMKII), FK506 결합 단백질 (FKBPs), 칼세퀘스트린 (CSQ), 트리아딘 및 junctin1,2,3,4,5,6에 의해 조절되는 칼슘 신호전달 경로의 주요 플레이어이다. . 이러한 단백질의 비정상적인 인간 발현 및 돌연변이는 부정맥7 및 종양원성 증식8,9과 같은 병리학적 생리학을 야기할 수 있다.
FKBPs는 RyRs에 의해 소포체(ER)로부터의 칼슘 방출을 조절한다. 이 과정은 수축 메커니즘에 필수적이며, 따라서 배아 RyRs1,2와 함께 칼슘 유도 칼슘 방출을 통해 미오신 액틴 수축에 의해 생성 된 모든 기계적 움직임을 담당합니다. 마우스 모델에서, RyR2 및 그 조절인자 FKBP12/Calstabin의 부족은 배아 발달 동안 또는 산후 초기 기간10,11,12에서 변함없이 치명적이다. FKBP12 / Calstabin 녹아웃 마우스는 배아 발달 중 불규칙한 여기 수축 결합 (EC) 및 뇌 부종으로 심각한 심장 결함을 나타냅니다. 이는 FKBP12/Calstabin이 심장 및 뇌 발달 모두에 중요한 RyR2 채널 발현을 조절하는 데 필수적인 역할을 한다는 것을 나타냅니다10.
RyR 실시 칼슘 스파크는 수정 된 메다카 난자의 접합체 형성 단계에서 처음 발견되었습니다13,14. 그러나 초기 배아 발달에서 칼슘 신호 전달의 기능에 대한 연구는 거의 수행되지 않았습니다. 초파리 멜라노가스터에서, DmFKBP12 S107 돌연변이체로부터 얻은 결과는 유충 발달과 건강한 수명에 대한이 유전자의 중요성을 뒷받침하는 강력한 증거를 제공하며, 이는 산화 스트레스에 대한 기능에 기인합니다15,16. 최근에, 우리는 초기 초파리 멜라노가스터 개발 동안 FKBP12/Calstabin 단백질 및 메신저 RNA의 동적 국소화를 확인했다17. 이 방법론에 기술된 접근법을 사용하여, 우리는 세포융합 배반엽 (0-2 h), 세포 배반배엽 (2-3 h), 초기 gastrula (3-12 h), 및 후기 gastrula (12-24 h) 동안 D. melanogaster에서 FKBP12/Calstabin의 발현을 추적할 수 있었다. 이 논문에서, 우리는 고전적인 파라핀 절편을 위한 전-배아 임베딩, 배아 절편에 대한 예비코팅 슬라이드 처리, 조직-화학 염색 및 면역염색, 유전자 발현의 확인을 위한 mRNA 인-시츄 혼성화를 포함하는 이전 연구에서 모든 접근법의 상세한 프로토콜을 제시한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
RyRs 및 IP3Rs 매개 칼슘 신호 전달은 척추 동물 및 무척추 동물 모두의 많은 생리 학적 및 병리학 적 과정에서 근본적인 경로입니다1,2,3,4. 인간에서, RyR2 유전자에서 CPVT 관련 R4496C 돌연변이와 같은 점 돌연변이는 심근세포의 사르코플라스마 망상으로부터 칼슘 누출을 유발하여, 심장 기능 장애를 초래?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (#31771377 / 31571273 / 31371256), 국립 교육부 (#MS2014SXSF038)의 외국 저명한 과학자 프로그램 (National Department of Education Central Universities Research Fund) (#GK201301001 / 201701005 / GERP-17-45)의 지원을 받았으며 XZ는 우수 박사 학위 논문 기금 (#2019TS082 / 2019TS079), 산시 성 교육부의 핵심 프로그램 (#20JS138), 산시 성 과학 기술부의 자연 과학 기초 연구 프로그램 청소년 프로젝트 (#2020JQ-885).
Materials
| -20°C Refrigerator | Meiling Biology &Medical | DW-YL270 | Used for regent storage |
| -80°C Ultra low temperature refrigerator | Thermo | Forma 90 Series | Used for regent storage |
| Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Preparation of grape juice agar plates |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Roche | 11093274910 | For the detection of digoxigenin-labeled compound |
| Biochemical incubator | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Hybridization |
| Bouin's solution | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69945460 | Drosophila Embryo Embedding |
| Centrifuge | Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hybridization |
| Centrifuge tube | Denville | C-2170 | Drosophila Embryo Collection |
| Chrome Alum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10001018 | Coating Slides |
| Constant temperature water bath | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Dako REAL EnVision Detection System | Dako | K5007 | In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | In-situ Hybridization |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11093274910 | RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | The stocks of Drosophila melanogaster mutant |
| Electric blast drying oven | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | For coating slides and paraffin embedding |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 100092680 | Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Gelatin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10010328 | Coating Slides |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 379948 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| High Pure PCR Product Purification Kit | Roche | 11732668001 | For purification of PCR products |
| Intelligent constant temperature and humidity box | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | For fly maintenance |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Pre-embedding |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10014108 | Drosophila Embryo Collection |
| Microscope | ZEISS | Observer.A1 | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Microscope Slides | MeVid Labware Manufacturing | P105-2001 | Coating Slides |
| Neutral Gum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10004160 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| N-heptane | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 40026768 | Drosophila Embryo Collection |
| Paraffin slicer | Huahai science instrument | HH-2508III | In-situ Hybridization |
| Paraffin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69019461 | Paraffin Embedding |
| pH/mV Meter | Sartorius | PB-10 | For determing the pH value of a solution |
| Silver nitrate | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10018461 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Ultrapure water meter | Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Hybridization |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10023418 | Paraffin Embedding |
Riferimenti
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