En protokoll for immunhiistokjemi og RNA in-situ distribusjon innen tidlig Drosophila embryo

Summary

Her beskriver vi en protokoll for deteksjon og lokalisering av Drosophila embryoprotein og RNA fra innsamling til pre-embedding og innebygging, immunstaining og mRNA in situ hybridisering.

Abstract

Kalsiumindusert kalsiumutslippssignal (CICR) spiller en kritisk rolle i mange biologiske prosesser. Hver cellulær aktivitet fra celleproliferasjon og apoptose, utvikling og aldring, til nevronal synaptisk plastisitet og regenerering har vært forbundet med Ryanodine reseptorer (RyRs). Til tross for viktigheten av kalsiumsignalering, er den eksakte mekanismen for funksjonen i tidlig utvikling uklar. Som en organisme med en kort svangerskapsperiode er embryoene til Drosophila melanogaster hovedstudieemner for å undersøke distribusjon og lokalisering av CICR-tilknyttede proteiner og deres regulatorer under utvikling. Men på grunn av deres lipidrike embryoer og chitinrike korion, er deres nytte begrenset av vanskeligheten med å montere embryoer på glassflater. I dette arbeidet introduserer vi en praktisk protokoll som betydelig forbedrer vedlegget av Drosophila embryo på lysbilder og detaljmetoder for vellykket histokjemi, immunhiistokjemi og in-situ hybridisering. Den krom alum gelatin lysbilde-belegg metode og embryo pre-embedding metode dramatisk øker utbyttet i å studere Drosophila embryo protein og RNA uttrykk. For å demonstrere denne tilnærmingen studerte vi DmFKBP12/Calstabin, en kjent regulator av RyR under tidlig embryonal utvikling av Drosophila melanogaster. Vi identifiserte DmFKBP12 i så tidlig som det synytiale blastodermstadiet og rapporterte det dynamiske uttrykksmønsteret til DmFKBP12 under utvikling: først som et jevnt distribuert protein i synytial blastoderm, deretter foreløpig lokalisering til kjellerlaget av cortex under cellulær blastoderm, før distribusjon i den primitive nevronale og fordøyelsesarkitekturen under tre-perle lagfasen i tidlig gastrulation. Denne fordelingen kan forklare den kritiske rollen RyR spiller i de vitale organsystemene som stammer fra disse lagene: det suboøsofageale og supraesophageal ganglion, ventrale nervesystemet og muskel-skjelettsystemet.

Introduction

Kalsiumindusert kalsiumutløsningssignalering (CICR) spiller en kritisk rolle i mange biologiske prosesser, for eksempel skjelett/glatt muskel- og hjertevaskulær funksjon, celleproliferasjon og apoptose, utvikling, aldring, nevronal synaptisk plastisitet og regenerering1,2,3,4,5,6 . Ryanodine reseptorer (RyRs) og inositol 1,4,5-trisfosfat reseptorer (IP3Rs) er store aktører i kalsium signalveien kontrollert av sine regulatorer protein kinase A (PKA), ^{Ca2 +}/calmodulin-avhengig protein kinase II (CaMKII), FK506 bindende proteiner (FKBPs), calsequestrin (CSQ), triadin og junctin1,2,3,4,5,6 . Unormalt menneskelig uttrykk og mutasjoner i disse proteinene kan føre til patologisk fysiologi som arytmier7 og onkogen ^spredning8,9.

FKBPs regulerer kalsiumutslippet fra endoplasmic reticular (ER) av RyRs. Denne prosessen er avgjørende for sammentrekningsmekanismen, og dermed ansvarlig for all mekanisk bevegelse generert av myosin-aktinkontraksjon gjennom kalsiumindusert kalsiumutslipp sammen med embryonale ^RyRs1,2. I musemodeller er mangelen på RyR2 og regulatoren FKBP12 /Calstabin alltid dødelig, enten under embryonal utvikling eller i tidlig barselperiode10,11,12. FKBP12/Calstabin knockout mus viser kritiske hjertefeil med uregelmessig eksitasjon- sammentrekningskobling (EC) og cerebral ødem under embryonal utvikling. Dette indikerer at FKBP12/Calstabin spiller en viktig rolle i reguleringen av RyR2 kanaluttrykk, noe som er viktig både for hjerte- og ^{hjerneutvikling10}.

RyR utførte kalsium gnister ble først oppdaget i zygote formasjonsfasen av befruktede Medaka ^egg13,14. Det er imidlertid gjort få undersøkelser om funksjonen til kalsiumsignalering i tidlig embryonal utvikling. I Drosophila melanogaster gir resultater hentet fra DmFKBP12 S107 mutanter sterke bevis som støtter betydningen av dette genet for larvutvikling og en sunn levetid, som tilskrives dens funksjon mot oksidativt ^stress15,16. Nylig identifiserte vi den dynamiske lokaliseringen av FKBP12 / Calstabin protein og messenger RNA under tidlig Drosophila melanogaster ^utvikling17. Ved hjelp av tilnærmingene beskrevet i denne metoden, var vi i stand til å spore uttrykket av FKBP12 / Calstabin i D. melanogaster under synkron blastoderm (0-2 h), cellulær blastoderm (2-3 h), tidlig gastrula (3-12 timer) og sen gastrula (12-24 h). I dette dokumentet presenterer vi de detaljerte protokollene for hver tilnærming i forrige studie, inkludert pre-embryo innebygging for klassisk parafinseksjon, pre-belegg lysbildebehandling for embryonale seksjoner, histokjemifarging og immunostaining, og mRNA in-situ hybridisering for identifisering av genuttrykk.

Protocol

1. Tilberedning av druejuice agarplater Tilsett 5 g agar og 5 g sukrose til 150 ml destillert vann. Kok den med en mikrobølgeovn til agaren og sukrose er helt oppløst. Bland 50 ml 100% druejuice og løsningen sammen. Tilsett 1 ml 100% propionsyre for å gjøre den endelige konsentrasjonen til 0,5% propionsyre. Hell 25 ml av den tilberedte løsningen i hver plate. Etter at agaren har størknet, oppbevar mediet i 4 °C. 2. Belegg lysbilder</stro…

Representative Results

Figurene beskriver protokoller som brukes for å overvinne utfordringen med å feste høy lipid og chitinholdige chorion Drosophila-embryoer (tabell 1) til glasssklieoverflaten for undersøkelse og eksperimentering. Ved hjelp av krom alum gelatin lysbildebeleggmetoden vist i figur 1, forbedret vi vedlegget av Drosophila-embryoer på overflaten av lysbilder mens embryoets pre-embedding-metode vist i figur 2 muliggjør effektiv i…

Discussion

RyRs og IP3Rs mediert kalsiumsignalering er en grunnleggende vei i mange fysiologiske og patologiske prosesser av både virveldyr og hvirvelløse dyr1,2,3,4. Hos mennesker fører punktmutasjoner, som CPVT-assosiert R4496C-mutasjon, i RyR2-genet til kalsiumlekkasje fra sarkoplasmisk retikulum av kardiomyocytt, noe som resulterer i hjertedysfunksjon. Disse mutasjonene presenterer som arytmi med h…

Materials

-20°C Refrigerator	Meiling Biology &Medical	DW-YL270	Used for regent storage
-80°C Ultra low temperature refrigerator	Thermo	Forma 90 Series	Used for regent storage
Agar	Sigma-Aldrich	WXBB6360V	Preparation of grape juice agar plates
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments	Roche	11093274910	For the detection of digoxigenin-labeled compound
Biochemical incubator	Shanghai Bluepard Instruments	LRH-250	In-situ Hybridization
Bouin's solution	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	69945460	Drosophila Embryo Embedding
Centrifuge	Eppendorf	540BH07808	In-situ Hybridization
Centrifuge tube	Denville	C-2170	Drosophila Embryo Collection
Chrome Alum	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10001018	Coating Slides
Constant temperature water bath	Jintan Henfeng Instruments	KW-1000DC	Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Dako REAL EnVision Detection System	Dako	K5007	In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining.
DEPC	Sigma-Aldrich	D5758	In-situ Hybridization
DIG RNA Labeling Kit	Roche	11093274910	RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase
Drosophila melanogaster	Bloomington Stock Center	BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664	The stocks of Drosophila melanogaster mutant
Electric blast drying oven	Tianjin Taiste Instruments	101-0AB	For coating slides and paraffin embedding
Eosin	Sigma-Aldrich	230251	Hematoxylin-Eosin Staining
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	100092680	Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Gelatin	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10010328	Coating Slides
Gold chloride	Sigma-Aldrich	379948	Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3136	Hematoxylin-Eosin Staining
High Pure PCR Product Purification Kit	Roche	11732668001	For purification of PCR products
Intelligent constant temperature and humidity box	Ningbo Jiangnan Instruments	HWS	For fly maintenance
LE Agarose	HyAgarose	14190108029	Pre-embedding
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10014108	Drosophila Embryo Collection
Microscope	ZEISS	Observer.A1	Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Microscope Slides	MeVid Labware Manufacturing	P105-2001	Coating Slides
Neutral Gum	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10004160	Hematoxylin-Eosin Staining
N-heptane	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	40026768	Drosophila Embryo Collection
Paraffin slicer	Huahai science instrument	HH-2508III	In-situ Hybridization
Paraffin	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	69019461	Paraffin Embedding
pH/mV Meter	Sartorius	PB-10	For determing the pH value of a solution
Silver nitrate	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10018461	Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Ultrapure water meter	Thermo	AFXI-0501-P	In-situ Hybridization
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10023418	Paraffin Embedding