Ett protokoll för immunohistokemi och RNA In-situ-distribution inom tidigt Drosophila-embryo
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för detektion och lokalisering av Drosophila embryoprotein och RNA från insamling till förinbäddning och inbäddning, immunfärgning och mRNA in situ-hybridisering .
Abstract
Kalciuminducerad kalciumfrisättningssignalering (CICR) spelar en avgörande roll i många biologiska processer. Varje cellulär aktivitet från cellproliferation och apoptos, utveckling och åldrande, till neuronal synaptisk plasticitet och regenerering har associerats med ryanodinreceptorer (RyRs). Trots vikten av kalciumsignalering är den exakta mekanismen för dess funktion i tidig utveckling oklar. Som en organism med en kort graviditetsperiod är embryon från Drosophila melanogaster primära studieämnen för att undersöka distributionen och lokaliseringen av CICR-associerade proteiner och deras regulatorer under utvecklingen. Men på grund av deras lipidrika embryon och kitinrika korion begränsas deras användbarhet av svårigheten att montera embryon på glasytor. I detta arbete introducerar vi ett praktiskt protokoll som avsevärt förbättrar fastsättningen av Drosophila-embryo på bilder och detaljmetoder för framgångsrik histokemi, immunohistokemi och in-situ-hybridisering . Glidbeläggningsmetoden för kromalungelgelatin och embryoförbäddningsmetoden ökar dramatiskt utbytet vid studier av Drosophila embryoprotein och RNA-uttryck. För att demonstrera detta tillvägagångssätt studerade vi DmFKBP12 / Calstabin, en välkänd regulator av RyR under tidig embryonal utveckling av Drosophila melanogaster. Vi identifierade DmFKBP12 i så tidigt som det syncytiella blastodermstadiet och rapporterar det dynamiska uttrycksmönstret för DmFKBP12 under utvecklingen: initialt som ett jämnt fördelat protein i syncytial blastoderm, sedan preliminärt lokaliserat till källarskiktet i cortex under cellulär blastoderm, innan det distribueras i den primitiva neuronala och matsmältningsarkitekturen under tre-gem-lagerfasen i tidig gastrulation. Denna fördelning kan förklara den kritiska roll RyR spelar i de vitala organsystemen som härrör från dessa lager: suboesofageal och supraesofageal ganglion, ventralt nervsystem och muskuloskeletala systemet.
Introduction
Kalciuminducerad kalciumfrisättningssignalering (CICR) spelar en avgörande roll i många biologiska processer, såsom skelett/glattmuskel och hjärtkärlfunktion, cellproliferation och apoptos, utveckling, åldrande, neuronal synaptisk plasticitet och regenerering1,2,3,4,5,6 . Ryanodinreceptorer (RyRs) och inositol 1,4,5-trisfosfatreceptorer (IP3R) är viktiga aktörer i kalciumsignalvägen som styrs av deras regulatorer proteinkinas A (PKA), Ca2+/calmodulinberoende proteinkinas II (CaMKII), FK506-bindande proteiner (KBP), kalsequestrin (CSQ), triadin och junctin1,2,3,4,5,6 . Onormalt mänskligt uttryck och mutationer i dessa proteiner kan leda till patologisk fysiologi såsom arytmier7 och onkogen proliferation8,9.
FKBP reglerar kalciumfrisättningen från endoplasmatisk retikulär (ER) av RyRs. Denna process är väsentlig för sammandragningsmekanismen och därmed ansvarig för all mekanisk rörelse som genereras av myosin-aktinkontraktion genom kalciuminducerad kalciumfrisättning tillsammans med embryonala RyRs1,2. I musmodeller är bristen på RyR2 och dess regulator FKBP12 / Calstabin alltid dödlig, antingen under embryonal utveckling eller i den tidiga postnatala perioden10,11,12. FKBP12/Calstabin knockout möss uppvisar kritiska hjärtfel med oregelbunden excitation- sammandragningskoppling (EC) och hjärnödem under embryonal utveckling. Detta indikerar att FKBP12/Calstabin spelar en viktig roll för att reglera RyR2-kanaluttryck, vilket är viktigt både för hjärt- och cerebral utveckling10.
RyR-ledda kalciumgnistrar upptäcktes ursprungligen i zygotbildningsfasen av befruktade Medaka-ägg13,14. Emellertid, få undersökningar har utförts på funktionen av kalcium signalering i tidig embryonal utveckling. I Drosophila melanogaster ger resultat erhållna från DmFKBP12 S107-mutanter starka bevis som stöder betydelsen av denna gen för larvutveckling och en hälsosam livslängd, vilket tillskrivs dess funktion mot oxidativ stress15,16. Nyligen identifierade vi den dynamiska lokaliseringen av FKBP12/Calstabinprotein och budbärar-RNA under tidig Drosophila melanogaster-utveckling17. Med hjälp av de metoder som beskrivs i denna metod kunde vi spåra uttrycket av FKBP12 / Calstabin i D. melanogaster under syncytial blastoderm (0-2 h), cellulär blastoderm (2-3 h), tidig gastrula (3-12 h) och sen gastrula (12-24 h). I detta dokument presenterar vi de detaljerade protokollen för varje tillvägagångssätt i den tidigare studien, inklusive inbäddning före embryo för klassisk paraffinsektion, förbeläggningsbehandling för embryonala sektioner, histokemifärgning och immunfärgning och mRNA in-situ hybridisering för identifiering av genuttryck.
Protocol
Representative Results
Discussion
RyRs och IP3Rs medierade kalciumsignalering är en grundläggande väg i många fysiologiska och patologiska processer hos både ryggradsdjur och ryggradslösa djur1,2,3,4. Hos människor leder punktmutationer, såsom CPVT-associerad R4496C-mutation, i RyR2-genen till kalciumläckage från sarkoplasmatisk retikulum av kardiomyocyter, vilket resulterar i hjärtdysfunktion. Dessa mutationer före…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (# 31771377 / 31571273 / 31371256), Foreign Distinguished Scientist Program från National Department of Education (#MS2014SXSF038), National Department of Education Central Universities Research Fund (#GK201301001 / 201701005 / GERP-17-45) och XZ stöds av Outstanding Doctoral Theal Thesis Fund (#2019TS082 / 2019TS079), Key Program of Shaanxi Provincial Education Department (#20JS138), natural science basic research program Youth Project of Shaanxi Provincial Science and Technology Department (#2020JQ-885).
Materials
| -20°C Refrigerator | Meiling Biology &Medical | DW-YL270 | Used for regent storage |
| -80°C Ultra low temperature refrigerator | Thermo | Forma 90 Series | Used for regent storage |
| Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Preparation of grape juice agar plates |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Roche | 11093274910 | For the detection of digoxigenin-labeled compound |
| Biochemical incubator | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Hybridization |
| Bouin's solution | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69945460 | Drosophila Embryo Embedding |
| Centrifuge | Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hybridization |
| Centrifuge tube | Denville | C-2170 | Drosophila Embryo Collection |
| Chrome Alum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10001018 | Coating Slides |
| Constant temperature water bath | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Dako REAL EnVision Detection System | Dako | K5007 | In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | In-situ Hybridization |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11093274910 | RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | The stocks of Drosophila melanogaster mutant |
| Electric blast drying oven | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | For coating slides and paraffin embedding |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 100092680 | Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Gelatin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10010328 | Coating Slides |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 379948 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| High Pure PCR Product Purification Kit | Roche | 11732668001 | For purification of PCR products |
| Intelligent constant temperature and humidity box | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | For fly maintenance |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Pre-embedding |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10014108 | Drosophila Embryo Collection |
| Microscope | ZEISS | Observer.A1 | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Microscope Slides | MeVid Labware Manufacturing | P105-2001 | Coating Slides |
| Neutral Gum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10004160 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| N-heptane | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 40026768 | Drosophila Embryo Collection |
| Paraffin slicer | Huahai science instrument | HH-2508III | In-situ Hybridization |
| Paraffin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69019461 | Paraffin Embedding |
| pH/mV Meter | Sartorius | PB-10 | For determing the pH value of a solution |
| Silver nitrate | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10018461 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Ultrapure water meter | Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Hybridization |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10023418 | Paraffin Embedding |
Riferimenti
- Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
- Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
- Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
- Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
- Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
- George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
- Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
- Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
- Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
- Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
- Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
- Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
- Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
- Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
- Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
- Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
- Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 633-645 (1958).
- Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
- Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
- Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
- Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
- Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the ‘resolution revolution’. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).
