En tre-dimensionel model af sfæroider til undersøgelse tyktarmskræft stamceller
Summary
Denne protokol præsenterer en ny, robust, og reproducerbare kultur system til at generere og vokse tre-dimensionelle sfæroider fra Caco2 kolon adenocarcinoma celler. Resultaterne giver den første proof-of-concept for hensigtsmæssigheden af denne tilgang til undersøgelse af kræft stamcellebiologi, herunder reaktionen på kemoterapi.
Abstract
Kolorektal cancer er kendetegnet ved heterogenitet og en hierarkisk organisation bestående af en population af kræft stamceller (CSC’ er) ansvarlig for tumor udvikling, vedligeholdelse og resistens over for narkotika. En bedre forståelse af CSC egenskaber for deres specifikke målretning er derfor en forudsætning for effektiv behandling. Der er dog mangel på egnede prækliniske modeller til dybdegående undersøgelser. Selv in vitro to-dimensionelle (2D) kræft cellelinjer giver værdifuld indsigt i tumor biologi, de ikke kopiere fænotypiske og genetiske tumor heterogenitet. I modsætning hertil adresserer tredimensionelle (3D) modeller og reproducerer næsten fysiologisk kræftkompleksitet og celle heterogenitet. Formålet med dette arbejde var at designe et robust og reproducerbart 3D-kultursystem til at studere CSC biologi. Denne metode beskriver udviklingen og optimeringen af betingelser for at generere 3D-sfæroider, som er homogene i størrelse, fra Caco2 kolon adenocarcinom celler, en model, der kan bruges til langsigtet kultur. Det er vigtigt, inden for sfæroider, de celler, der var organiseret omkring lumen-lignende strukturer, var kendetegnet ved differentialcellespredning mønstre og ved tilstedeværelsen af CSC’er udtrykke et panel af markører. Disse resultater giver den første proof-of-concept for hensigtsmæssigheden af denne 3D-tilgang til undersøgelse af celle heterogenitet og CSC biologi, herunder respons på kemoterapi.
Introduction
Tyk- og endetarmskræft (CRC) er fortsat den næststørste årsag til kræftrelaterede dødsfald i verden1. Udviklingen af CRC er resultatet af en progressiv erhvervelse og akkumulering af genetiske mutationer og / eller epigenetiske ændringer2,3, herunder aktivering af onkogener og inaktivering af tumor suppressor gener3,4. Desuden kan ikke-genetiske faktorer (f.eks. mikromiljøet) bidrage til og fremme onkogen transformation og dermed deltage i udviklingen af CFC5. Det er vigtigt, AT’er består af forskellige cellepopulationer, herunder udifferentierede CSC’er og bulk tumorceller, der viser nogle differentieringsegenskaber, som udgør en hierarkisk struktur, der minder om epitelets organisation i en normal kolonkrypt6,7.
CSC’er anses for at være ansvarlige for tumorudseende8, dets vedligeholdelse og vækst, metastatisk kapacitet og modstand mod konventionelle terapier6,7. Inden for tumorer, kræftceller, herunder CSC’er, vise en høj grad af heterogenitet og kompleksitet med hensyn til deres forskellige mutationelle og epigenetiske profiler, morfologiske og fænotypiske forskelle, genekspression, stofskifte, spredning satser, og metastatisk potentiale9. Derfor, for bedre at forstå kræftbiologi, tumorprogression og erhvervelse af resistens over for terapi og dens oversættelse til effektive behandlinger, er menneskelige prækliniske modeller, der fanger denne kræft heterogenitet og hierarki, vigtige10,11.
In vitro 2D kræft cellelinjer har været brugt i lang tid og give værdifuld indsigt i tumor udvikling og de mekanismer, der ligger til grund for effekten af terapeutiske molekyler. Men deres begrænsning med hensyn til manglen på den fænotypiske og genetiske heterogenitet, der findes i de oprindelige tumorer, er nu bredt anerkendt12. Desuden er næringsstoffer, ilt, pH-gradienter og tumormikromiljøet ikke gengivet, idet mikromiljøet er særligt vigtigt for vedligeholdelsen af forskellige celletyper, herunder CSC’er11,12. For at overvinde disse vigtigste ulemper er der udviklet flere 3D-modeller til eksperimentelt at adressere og reproducere kompleksiteten og heterogeniteten af kræft. I realiteten opsummerer disse modeller tumor cellulær heterogenitet, cellecelleinteraktioner og rumlig arkitektur, svarende til dem, der er observeret in vivo12,13,14. Primære tumororganoider etableret fra friske tumorer, såvel som cellelinjeafledte sfæroider, er stort set ansat15,16.
Spheroids kan dyrkes på en stilladsfri eller stilladsbaseret måde for at tvinge cellerne til at danne og vokse i celleaggregater. Stilladsfrie metoder er baseret på cellernes kultur under ikke-klæbende forhold (f.eks. hængende dråbemetoden eller ultralave fastgørelsesplader), mens stilladsbaserede modeller er afhængige af naturlige, syntetiske eller hybride biomaterialer til kulturceller12,13,14. Stilladsbaserede sfæroider frembyder forskellige ulemper, da den endelige sfæroiddannelse vil afhænge af arten og sammensætningen af det anvendte (bio)materiale. Selvom de stilladsfrie sfæroidmetoder, der er tilgængelige indtil videre, ikke er afhængige af substratets art, genererer de sfæroider, der varierer i struktur og størrelse17,18.
Dette arbejde havde til formål at designe et robust og reproducerbart 3D-dyrkningssystem af sfæroider, som er homogene i størrelse, sammensat af Caco2 kolon adenocarcinomceller til at studere CSC biologi. Caco2 celler er af særlig interesse på grund af deres evne til at differentiere over tid19,20, stærkt tyder på en stængel-lignende potentiale. Derfor afslørede den langsigtede kultur af spheroids tilstedeværelsen af forskellige CSC-populationer med forskellige reaktioner på kemoterapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vitro 3D-modeller overvinde de vigtigste eksperimentelle ulemper ved 2D kræft cellekulturer, da de synes at være mere pålidelige i rekapitalisering typiske tumorale træk, herunder mikromiljø og celle heterogenitet. Almindeligt anvendte 3D-modeller af sfæroider er stilladsfri (dyrket i lav-vedhæftede forhold) eller stilladsbaserede (ved hjælp af biomaterialer til kulturceller). Disse metoder frembyder forskellige ulemper, da de afhænger af arten af det anvendte stillads eller giver anledning til sfæroider, de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender billedbehandling og Anipath recherche histologi platforme (CRCL, CLB). Vi står i gæld til apoteket på Center Léon Bérard (CLB) Hospital for den slags gave folfox og FOLFIRI. Vi takker også Brigitte Manship for kritisk læsning af manuskriptet. Arbejdet blev støttet af FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) og af Inca (PLBIO19-289). MVG og LC modtog støtte fra FRM og CF modtog støtte fra ARC foundation og Centre Léon Bérard.
Materials
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | – | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 – Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) – Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) – Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA – Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin – Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
Riferimenti
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Fearon, E. R., Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61 (5), 759-767 (1990).
- Rao, C. V., Yamada, H. Y. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes. Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).
- Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).
- Tran, T. Q., et al. α-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer. Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).
- Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
- Clevers, H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).
- Kawai, S., et al. Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments. Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).
- Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
- Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Weiswald, L. -. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Silva-Almeida, C., Ewart, M. -. A., Wilde, C. 3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).
- Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines. Ricerca sul cancro. 48 (7), 1936-1942 (1988).
- Caro, I., et al. Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).
- Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates. Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).
- Wolpin, B. M., Mayer, R. J. Systemic treatment of colorectal cancer. Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).
- Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).
- Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).
- Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy. World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).
- Jordan, N. J., et al. Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro. Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).
- Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), 59689 (2013).
- Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Nusse, R., Clevers, H. Wnt/β-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
- Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
- Vermeulen, L., Snippert, H. J. Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).
- van der Heijden, M., Vermeulen, L. Stem cells in homeostasis and cancer of the gut. Molecular Cancer. 18 (1), 66 (2019).
- Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs. Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- Potten, C. S., et al. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).
- Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
- Clark, D. W., Palle, K. Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets. Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).
- Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
- Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).
- Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance. Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).
- Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance. Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).
