Ein dreidimensionales Modell von Sphäroiden zur Untersuchung von Darmkrebs-Stammzellen
Summary
Dieses Protokoll stellt ein neuartiges, robustes und reproduzierbares Kultursystem zur Erzeugung und zum Wachstum dreidimensionaler Sphäroide aus Caco2-Kolonadenokarzinomzellen dar. Die Ergebnisse liefern den ersten Proof-of-Concept für die Angemessenheit dieses Ansatzes zur Untersuchung der Krebsstammzellbiologie, einschließlich der Reaktion auf Chemotherapie.
Abstract
Darmkrebs ist durch Heterogenität und eine hierarchische Organisation gekennzeichnet, die eine Population von Krebsstammzellen (CSCs) umfasst, die für die Tumorentwicklung, -erhaltung und -resistenz gegen Medikamente verantwortlich sind. Ein besseres Verständnis der CSC-Eigenschaften für ihre spezifische Ausrichtung ist daher eine Voraussetzung für eine effektive Therapie. Es gibt jedoch einen Mangel an geeigneten präklinischen Modellen für eingehende Untersuchungen. Obwohl in vitro zweidimensionale (2D) Krebszelllinien wertvolle Einblicke in die Tumorbiologie liefern, replizieren sie die phänotypische und genetische Tumorheterogenität nicht. Im Gegensatz dazu adressieren und reproduzieren dreidimensionale (3D) Modelle die nahe physiologische Krebskomplexität und Zellheterogenität. Ziel dieser Arbeit war es, ein robustes und reproduzierbares 3D-Kultursystem zu entwerfen, um CSC-Biologie zu studieren. Die vorliegende Methodik beschreibt die Entwicklung und Optimierung von Bedingungen zur Erzeugung von 3D-Sphäroiden, die homogen in der Größe sind, aus Caco2-Kolon-Adenokarzinomzellen, einem Modell, das für die langfristige Kultur verwendet werden kann. Wichtig ist, dass innerhalb der Sphäroide die Zellen, die um lumenartige Strukturen organisiert waren, durch differentiale Zellproliferationsmuster und durch das Vorhandensein von CSCs gekennzeichnet waren, die ein Panel von Markern ausdrückten. Diese Ergebnisse liefern den ersten Proof-of-Concept für die Angemessenheit dieses 3D-Ansatzes zur Untersuchung der Zellheterogenität und CSC-Biologie, einschließlich der Reaktion auf Chemotherapie.
Introduction
Darmkrebs (CRC) ist nach wie vor die zweithäufigste Ursache für krebsassoziierte Todesfälle weltweit1. Die Entwicklung von SCRC ist das Ergebnis einer fortschreitenden Erfassung und Akkumulation genetischer Mutationen und/oder epigenetischer Veränderungen2,3, einschließlich der Aktivierung von Onkogenen und der Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen3,4. Darüber hinaus können nichtgenetische Faktoren (z. B. die Mikroumgebung) zur onkogenen Transformation beitragen und diese fördern und somit an der Entwicklung der SFB5teilnehmen. Wichtig ist, dass CRCs aus verschiedenen Zellpopulationen bestehen, einschließlich undifferenzierter CSCs und Massentumorzellen, die einige Differenzierungsmerkmale aufweisen, die eine hierarchische Struktur darstellen, die an die Organisation des Epithels in einer normalen Doppelpunktkryptaerinnert 6,7.
CSCs gelten als verantwortlich für Tumor aussehen8, seine Wartung und Wachstum, metastasierende Kapazität, und Resistenz gegen konventionelle Therapien6,7. Innerhalb von Tumoren weisen Krebszellen, einschließlich CSCs, ein hohes Maß an Heterogenität und Komplexität in Bezug auf ihre ausgeprägten Mutations- und Epigenetischen Profile, morphologische und phäkotypische Unterschiede, Genexpression, Stoffwechsel, Proliferationsraten und metastasisches Potenzialauf 9. Daher, um Krebsbiologie besser zu verstehen, Tumorprogression, und Erwerb der Resistenz gegen Therapie und ihre Umsetzung in wirksame Behandlungen, menschliche präklinische Modelle erfassung diese Krebsheterogenität und Hierarchie sind wichtig10,11.
In-vitro-2D-Krebszelllinien werden seit langem verwendet und liefern wertvolle Einblicke in die Tumorentwicklung und die Mechanismen, die der Wirksamkeit therapeutischer Moleküle zugrunde liegen. Jedoch, ihre Beschränkung in Bezug auf das Fehlen der phänotypischen und genetischen Heterogenität in den ursprünglichen Tumoren gefunden ist jetzt weithin anerkannt12. Darüber hinaus werden Nährstoffe, Sauerstoff, pH-Gradienten und die Tumormikroumgebung nicht reproduziert, wobei die Mikroumgebung für die Aufrechterhaltung verschiedener Zelltypen, einschließlich CSCs11,12,besonders wichtig ist. Um diese Hauptnachteile zu überwinden, wurden mehrere 3D-Modelle entwickelt, um die Komplexität und Heterogenität von Krebsen experimentell anzugehen und zu reproduzieren. In der Tat rekapitulieren diese Modelle tumorzelluläre Heterogenität, Zell-Zell-Interaktionen und räumliche Architektur, ähnlich denen, die in vivo12,13,14beobachtet wurden. Primäre Tumororganoide, die aus frischen Tumoren sowie zelllinienabgeleiteten Sphäroiden hergestellt werden, werden größtenteils15,16eingesetzt.
Sphäroide können auf Gerüst-freie oder Gerüstbasis kultiviert werden, um die Zellen zu zwingen, sich in Zellaggregaten zu bilden und zu wachsen. Gerüstfreie Methoden basieren auf der Kultur von Zellen unter nicht haftenden Bedingungen (z.B. die Hängetropfenmethode oder ultraniedrige Aufsatzplatten), während Gerüstmodelle auf natürlichen, synthetischen oder hybriden Biomaterialien zu Kulturzellen12,13,14basieren. Gerüst-basierte Sphäroide stellen unterschiedliche Nachteile dar, da die endgültige Sphäroidbildung von der Art und Zusammensetzung des verwendeten (Bio-)Materials abhängt. Obwohl die gerüstfreien Sphäroid-Methoden, die bisher zur Verfügung stehen, nicht auf die Art des Substrats angewiesen sind, erzeugen sie Sphäroide, die in Struktur und Größe17,18variieren.
Diese Arbeit zielte darauf ab, ein robustes und reproduzierbares 3D-Kultursystem von Sphäroiden zu entwerfen, die homogen in der Größe sind und aus Caco2-Kolonadenokarzinomzellen bestehen, um die CSC-Biologie zu studieren. Caco2-Zellen sind von besonderem Interesse aufgrund ihrer Fähigkeit, im Laufe der Zeit zu differenzieren19,20, stark auf ein Stammpotenzial hindeutend. Dementsprechend zeigte die Langzeitkultur der Sphäroide das Vorhandensein verschiedener CSC-Populationen mit unterschiedlichen Reaktionen auf die Chemotherapie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In-vitro-3D-Modelle überwinden die wichtigsten experimentellen Nachteile von 2D-Krebszellkulturen, da sie bei der Rekapitulation typischer Tumormerkmale wie Mikroumgebung und Zellheterogenität zuverlässiger zu sein scheinen. Häufig verwendete 3D-Modelle von Sphäroiden sind gerüstfrei (kultiviert unter niedriganbaulichen Bedingungen) oder Gerüstbasis (mit Biomaterialien zur Kulturvon Zellen). Diese Methoden weisen unterschiedliche Nachteile auf, da sie von der Art des verwendeten Gerüsts abhängen oder sphäroide …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir erkennen die Imaging- und Anipath-Recherche-Histologie-Plattformen (CRCL, CLB) an. Wir sind der Apotheke des Centre Léon Bérard (CLB) Krankenhauses für das freundliche Geschenk von FOLFOX und FOLFIRI zu verdanken. Wir danken auch Brigitte Manship für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die Arbeiten wurden vom FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) und der Inca (PLBIO19-289) unterstützt. MVG und LC erhielten Unterstützung von der FRM und CF erhielt Unterstützung von der ARC-Stiftung und dem Centre Léon Bérard.
Materials
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | – | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 – Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) – Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) – Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA – Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin – Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
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