대장암 줄기세포를 연구하는 스페로이드의 3차원 모델
Summary
이 프로토콜은 Caco2 결장 아데노암종 세포에서 3차원 스페로이드를 생성하고 성장시키는 새로운 견고하고 재현 가능한 배양 시스템을 제공합니다. 결과는 화학요법에 대한 반응을 포함하여 암 줄기 세포 생물학을 공부하는 이 접근의 적합성을 위한 개념증명을 제공합니다.
Abstract
대장암은 종양 발달, 유지 보수 및 약물에 대한 내성을 담당하는 암 줄기세포(CSC)의 인구를 포함하는 이질성 및 계층적 조직을 특징으로 한다. 그들의 특정 표적을 위한 CSC 속성의 더 나은 이해는, 그러므로, 효과적인 치료를 위한 전제 조건입니다. 그러나 심층 조사에 적합한 전임상 모델이 부족합니다. 시험관 내 2차원 (2D) 암 세포주가 종양 생물학에 귀중한 통찰력을 제공하지만, 그들은 현상및 유전 종양 이질성을 복제하지 않습니다. 대조적으로, 3차원 (3D) 모형은 거의 생리적인 암 복잡성 및 세포 이질성을 해결하고 재현합니다. 이 작업의 목적은 CSC 생물학을 연구하기 위해 강력하고 재현 가능한 3D 문화 시스템을 설계하는 것이었습니다. 본 방법론은 장기 배양에 사용될 수 있는 모델인 Caco2 결장 아데노암종 세포로부터 동질적인 3D 스페로이드를 생성하는 조건의 개발 및 최적화를 설명합니다. 중요한 것은, 스페로이드 내에서, 루멘과 같은 구조물을 중심으로 조직된 세포는, 차동 세포 증식 패턴및 마커 패널을 표현하는 CSC의 존재에 의해 특징지어졌다. 이러한 결과는 화학요법에 대한 반응을 포함하여 세포 이질성 및 CSC 생물학을 연구하기 위한 이 3D 접근법의 적합성을 위한 첫 번째 개념 증명을 제공합니다.
Introduction
대장암(CRC)은 세계1에서암 관련 사망의 두 번째 주요 원인으로 남아 있다. CRC의 발달은 종양 억제 유전자3,4의온코진 활성화 및 불활성화를 포함하는 유전 돌연변이 및/또는 후성유전학 적 변경2,3의점진적 습득 및 축적의 결과입니다. 더욱이, 비유전적 요인(예를 들어, 마이크로환경)은 종양성 변혁에 기여하고 촉진하여 CRC5의진화에 참여할 수 있다. 중요한 것은, CRC는 정상 결장 토굴6,7에서상피의 조직을 연상시키는 계층 구조를 구성하는 일부 분화 된 CSC 및 벌크 종양 세포를 포함한 상이한 세포 집단으로 구성된다.
CSC는 종양 출현8,유지 보수 및 성장, 전이성 용량 및 종래의 치료법에 대한 내성을 담당하는 것으로 간주됩니다6,7. 종양 내에서, CSC를 포함한 암세포는 그들의 명백한 돌연변이 및 후성 유전학 단면도, 형태학 및 표현성 다름, 유전자 발현, 물질 대사, 증식 비율 및 전이성 전위9의관점에서 이질성과 복잡성의 높은 수준을 표시합니다. 따라서, 암 생물학, 종양 진행, 효과적인 치료법으로의 내성 획득, 이 암 이질성 및 계층 구조를 포착하는 인간 전임상 모델은10,11에중요하다.
체외 2D 암 세포주에서 는 오랫동안 사용되어 왔으며 종양 발달과 치료 분자의 효능의 근간이 되는 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 그러나, 본래 종양에서 발견되는 현상및 유전적 이질성의 부족에 대하여 그들의 한계는 지금 널리 인식된다12. 더욱이, 영양분, 산소, pH 그라데이션 및 종양 미세환경은 재현되지 않으며, 마이크로환경은CSC(11,12)를포함한 상이한 세포 유형의 유지에 특히 중요하다. 이러한 주요 단점을 극복하기 위해 여러 3D 모델이 실험적으로 암의 복잡성과 이질성을 해결하고 재현하기 위해 개발되었습니다. 실제로, 이들 모델은 생체 내12,13,14에서관찰된 것과 유사한 종양 세포 이질성, 세포 세포 상호 작용 및 공간아키텍처를재구성한다. 신선한 종양뿐만 아니라 세포 주 유래 스페로이드에서 확립된 1차 종양 오르가노이드는 주로15,16으로채용된다.
스페로이드는 세포가 세포 응집체에서 형성되고 성장하도록 강제하기 위해 비계가 없거나 스캐폴드 기반 방식으로 배양될 수 있다. 스캐폴드 프리 방법은 비부착 조건(예를 들어, 매달려 드롭 방법 또는 초저부착 플레이트)의 세포 배양에 기초한 반면, 스캐폴드 기반 모델은 천연, 합성 또는 하이브리드 생체 재료에 의존하여배양세포(12,13,14)에의존한다. 스캐폴드 계 스페로이드는 최종 스페로이드 형성이 사용되는 (바이오) 물질의 성질과 조성에 따라 달라지기 때문에 상이한 단점을 제시한다. 지금까지 사용할 수있는 스캐폴드프리 스페로이드 방법은 기판의 특성에 의존하지 않지만 구조및 크기17,18에따라 달라지는 스페로이드를 생성한다.
이 연구는 CSC 생물학을 공부하기 위하여 Caco2 결장 선암 세포로 구성된 크기에서 균질한 spheroids의 견고하고 재현가능한 3D 배양 시스템을 설계하는 것을 목표로 했습니다. Caco2 세포는 시간이 지남에 따라 분화 하는 그들의 능력에 때문에 특히 관심19,20,강하게 줄기 같은 잠재력을 제안. 이에 따라, 스페로이드의 장기 문화는 화학요법에 다른 반응을 가진 다른 CSC 인구의 존재를 밝혔습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
체외 3D 모델은 2D 암 세포 배양의 주요 실험적 단점을 극복, 그들은 미세 환경 과 세포 이질성을 포함한 전형적인 종양 기능을 다시 항복에 더 신뢰할 것으로 보인다. 일반적으로 사용되는 3D 스푸로이드 모델은 스캐폴드가 없는(저부착 조건에서 배양됨) 또는 스캐폴드 기반(생체 물질을 배양 세포에 사용)이다. 이러한 방법은 사용되는 비계의 특성에 의존하거나 구조와 크기가 가변적인 스페로이?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 이미징 및 애니패스가 조직학 플랫폼(CRCL, CLB)을 재구성한다는 것을 인정합니다. 우리는 FOLFOX와 FOLFIRI의 친절한 선물을 위해 센터 레옹 베라드 (CLB) 병원의 약국에 빚지고 있습니다. 우리는 또한 원고의 비판적 독서에 대한 브리기테 맨십감사합니다. 이 작품은 FRM(Equipes FRM 2018, DEQ20181039598)과 Inca(PLBIO19-289)에 의해 지원되었습니다. MVG와 LC는 FRM의 지원을 받았고 CF는 ARC 재단과 센터 레옹 베라드의 지원을 받았습니다.
Materials
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | – | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 – Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) – Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) – Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA – Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin – Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
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