Een driedimensionaal model van sferoïden om stamcellen van darmkanker te bestuderen
Summary
Dit protocol presenteert een nieuw, robuust en reproduceerbaar kweeksysteem om driedimensionale sferoïden uit Caco2 colon adenocarcinoomcellen te genereren en te laten groeien. De resultaten vormen de eerste proof-of-concept voor de geschiktheid van deze aanpak om kankerstamcelbiologie te bestuderen, inclusief de respons op chemotherapie.
Abstract
Colorectale kankers worden gekenmerkt door heterogeniteit en een hiërarchische organisatie bestaande uit een populatie van kankerstamcellen (CSC’s) die verantwoordelijk zijn voor tumorontwikkeling, onderhoud en resistentie tegen geneesmiddelen. Een beter begrip van CSC-eigenschappen voor hun specifieke targeting is daarom een vereiste voor effectieve therapie. Er is echter een tekort aan geschikte preklinische modellen voor diepgaand onderzoek. Hoewel in vitro tweedimensionale (2D) kankercellijnen waardevolle inzichten bieden in tumorbiologie, repliceren ze de fenotypische en genetische tumor heterogeniteit niet. Driedimensionale (3D)-modellen daarentegen pakken bijna-fysiologische kankercomplexiteit en cel heterogeniteit aan en reproduceren deze. Het doel van dit werk was om een robuust en reproduceerbaar 3D-cultuursysteem te ontwerpen om CSC-biologie te bestuderen. De huidige methodologie beschrijft de ontwikkeling en optimalisatie van omstandigheden om 3D-sferoïden, die homogeen van grootte zijn, te genereren uit Caco2 colon adenocarcinoomcellen, een model dat kan worden gebruikt voor langetermijncultuur. Belangrijk is dat binnen de sferoïden de cellen die waren georganiseerd rond lumenachtige structuren, werden gekenmerkt door differentiële celproliferatiepatronen en door de aanwezigheid van CSC’s die een paneel van markers uitdrukken. Deze resultaten vormen de eerste proof-of-concept voor de geschiktheid van deze 3D-benadering om cel heterogeniteit en CSC-biologie te bestuderen, inclusief de respons op chemotherapie.
Introduction
Colorectale kanker (CRC) blijft de tweede belangrijkste oorzaak van kanker-geassocieerde sterfgevallen in de wereld1. De ontwikkeling van CRC is het resultaat van een progressieve verwerving en accumulatie van genetische mutaties en/of epigenetische veranderingen2,3, met inbegrip van de activering van oncogenen en inactivatie van tumoronderdrukkergenen3,4. Bovendien kunnen niet-genetische factoren (bv. het micromilieu) bijdragen tot en de oncogene transformatie bevorderen en zo deelnemen aan de ontwikkeling van CRC’s5. Belangrijk is dat CRC’s bestaan uit verschillende celpopulaties, waaronder ongedifferentieerde CSC’s en bulktumorcellen die enkele differentiatiekenmerken vertonen, die een hiërarchische structuur vormen die doet denken aan de organisatie van het epitheel in een normale coloncrypte 6,7.
CSC ‘s worden geacht verantwoordelijk te zijn voor het verschijnen vantumoren 8, het onderhoud en de groei ervan, de gemetastaseerde capaciteit en de resistentie tegen conventionele therapieën6,7. Binnen tumoren vertonen kankercellen, waaronder CSC’s, een hoog niveau van heterogeniteit en complexiteit in termen van hun verschillende mutatie- en epigenetische profielen, morfologische en fenotypische verschillen, genexpressie, metabolisme, proliferatiepercentages en gemetastaseerd potentieel9. Daarom, om kankerbiologie, tumorprogressie en het verwerven van resistentie tegen therapie en de vertaling ervan in effectieve behandelingen beter te begrijpen, zijn menselijke preklinische modellen die deze kanker heterogeniteit en hiërarchie vastleggen belangrijk10,11.
In vitro 2D-kankercellijnen worden al lange tijd gebruikt en bieden waardevolle inzichten in tumorontwikkeling en de mechanismen die ten grondslag liggen aan de werkzaamheid van therapeutische moleculen. Hun beperking met betrekking tot het ontbreken van de fenotypische en genetische heterogeniteit gevonden in de oorspronkelijke tumoren wordt nu echter algemeen erkend12. Bovendien worden nutriënten, zuurstof, pH-gradiënten en het micromilieu van de tumor niet gereproduceerd, waarbij het micromilieu vooral belangrijk is voor het behoud van verschillende celtypen, waaronder CSC’s11,12. Om deze belangrijkste nadelen te overwinnen, zijn verschillende 3D-modellen ontwikkeld om de complexiteit en heterogeniteit van kankers experimenteel aan te pakken en te reproduceren. In feite vatten deze modellen tumor cellulaire heterogeniteit, cel-cel interacties en ruimtelijke architectuur samen, vergelijkbaar met die waargenomen in vivo12,13,14. Primaire tumororganoïden die zijn vastgesteld op basis van verse tumoren, evenals van cellijn afgeleide sferoïden, worden grotendeels gebruikt15,16.
Sferoïden kunnen op een steigervrije of steigergebaseerde manier worden gekweekt om de cellen te dwingen zich te vormen en te groeien in celaggregaten. Steigervrije methoden zijn gebaseerd op de cultuur van cellen onder niet-aanhangende omstandigheden (bv. de ophangingsmethode of ultralage bevestigingsplaten), terwijl steigermodellen afhankelijk zijn van natuurlijke, synthetische of hybride biomaterialen voor kweekcellen12,13,14. Op steigers gebaseerde sferoïden hebben verschillende nadelen, omdat de uiteindelijke sferoïdevorming afhankelijk is van de aard en samenstelling van het gebruikte (bio)materiaal. Hoewel de tot nu toe beschikbare steigervrije sferoïdemethoden niet afhankelijk zijn van de aard van het substraat, genereren ze sferoïden die variëren in structuur en grootte17,18.
Dit werk was gericht op het ontwerpen van een robuust en reproduceerbaar 3D-kweeksysteem van sferoïden, die homogeen van grootte zijn, samengesteld uit Caco2 colon adenocarcinoomcellen om CSC-biologie te bestuderen. Caco2-cellen zijn van bijzonder belang vanwege hun vermogen om in de loop van de tijd19,20te differentiëren , wat sterk wijst op een stamachtig potentieel. Dienovereenkomstig onthulde de langetermijncultuur van de sferoïden de aanwezigheid van verschillende CSC-populaties met verschillende reacties op chemotherapie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vitro 3D-modellen overwinnen de belangrijkste experimentele nadelen van 2D-kankercelculturen, omdat ze betrouwbaarder lijken te zijn bij het samenvatten van typische tumorkenmerken, waaronder micromilieu en cel heterogeniteit. Veelgebruikte 3D-modellen van sferoïden zijn steigervrij (gekweekt in omstandigheden met weinig bevestiging) of steigergebaseerd (met behulp van biomaterialen om cellen te gekweekt). Deze methoden vertonen verschillende nadelen omdat ze afhankelijk zijn van de aard van de gebruikte steiger of a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen de platforms voor beeldvorming en Anipath recherche histologie (CRCL, CLB). We zijn de apotheek van het Centre Léon Bérard (CLB) Hospital schatplichtig voor het soort geschenk van FOLFOX en FOLFIRI. We danken brigittemanship ook voor het kritisch lezen van het manuscript. Het werk werd ondersteund door de FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) en door de Inca (PLBIO19-289). MVG en LC kregen steun van de FRM en CF kreeg steun van arc foundation en het Centre Léon Bérard.
Materials
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | – | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 – Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) – Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) – Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA – Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin – Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
Riferimenti
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Fearon, E. R., Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61 (5), 759-767 (1990).
- Rao, C. V., Yamada, H. Y. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes. Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).
- Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).
- Tran, T. Q., et al. α-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer. Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).
- Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
- Clevers, H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).
- Kawai, S., et al. Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments. Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).
- Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
- Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Weiswald, L. -. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Silva-Almeida, C., Ewart, M. -. A., Wilde, C. 3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).
- Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines. Ricerca sul cancro. 48 (7), 1936-1942 (1988).
- Caro, I., et al. Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).
- Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates. Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).
- Wolpin, B. M., Mayer, R. J. Systemic treatment of colorectal cancer. Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).
- Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).
- Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).
- Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy. World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).
- Jordan, N. J., et al. Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro. Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).
- Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), 59689 (2013).
- Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Nusse, R., Clevers, H. Wnt/β-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
- Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
- Vermeulen, L., Snippert, H. J. Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).
- van der Heijden, M., Vermeulen, L. Stem cells in homeostasis and cancer of the gut. Molecular Cancer. 18 (1), 66 (2019).
- Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs. Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- Potten, C. S., et al. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).
- Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
- Clark, D. W., Palle, K. Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets. Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).
- Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
- Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).
- Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance. Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).
- Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance. Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).
