En tredimensionell modell av sfäroider för att studera tjocktarmscancerstamceller
Summary
Detta protokoll presenterar ett nytt, robust och reproducerbart odlingssystem för att generera och odla tredimensionella sfäroider från Caco2 kolon adenocarcinom celler. Resultaten ger det första proof-of-concept för lämpligheten av detta tillvägagångssätt för att studera cancer stamcellsbiologi, inklusive svaret på kemoterapi.
Abstract
Kolorektal cancer kännetecknas av heterogenitet och en hierarkisk organisation som består av en population av cancerstamceller (CSCs) som ansvarar för tumörutveckling, underhåll och resistens mot läkemedel. En bättre förståelse för CSC egenskaper för deras specifika inriktning är därför en pre-nödvändiga för effektiv terapi. Det finns dock en brist på lämpliga prekliniska modeller för djupgående undersökningar. Även om in vitro tvådimensionella (2D) cancer cellinjer ger värdefulla insikter i tumör biologi, replikerar de inte fenotypiska och genetiska tumör heterogenitet. Däremot adresserar och reproducerar tredimensionella (3D) modeller nära fysiologisk cancerkomplexitet och cell heterogenitet. Syftet med detta arbete var att utforma ett robust och reproducerbart 3D-odlingssystem för att studera CSC-biologi. Den nuvarande metoden beskriver utveckling och optimering av villkor för att generera 3D-sfäroider, som är homogena i storlek, från Caco2 kolon adenocarcinom celler, en modell som kan användas för långsiktig kultur. Viktigt, inom sfäroiderna, cellerna som var organiserade runt lumen-liknande strukturer, kännetecknades av differentiella cell spridning mönster och av förekomsten av CSCs uttrycker en panel av markörer. Dessa resultat ger det första proof-of-concept för lämpligheten av denna 3D-metod för att studera cell heterogenitet och CSC biologi, inklusive svaret på kemoterapi.
Introduction
Kolorektal cancer (CRC) är fortfarande den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall i världen1. Utvecklingen av CRC är resultatet av ett progressivt förvärv och ackumulering av genetiska mutationer och/eller epigenetiska förändringar2,3, inklusive aktivering av onkogenes och inaktivering av tumör suppressor gener3,4. Dessutom kan icke-genetiska faktorer (t.ex. mikromiljön) bidra till och främja onkogen omvandling och därmed delta i utvecklingen av CRC5. Viktigt är att CRC består av olika cellpopulationer, inklusive odifferentierade CSC och bulktumörceller som uppvisar vissa differentieringsegenskaper, som utgör en hierarkisk struktur som påminner om epitelens organisation i en normal kolonkryp6,7.
CSCs anses vara ansvariga för tumör utseende8,dess underhåll och tillväxt, ögonbevarande kapacitet och resistens mot konventionella terapier6,7. Inom tumörer uppvisar cancerceller, inklusive CSCs, en hög nivå av heterogenitet och komplexitet när det gäller deras distinkta mutations- och epigenetiska profiler, morfologiska och fenotypiska skillnader, genuttryck, metabolism, spridningshastigheter och metastaserad potential9. Därför, för att bättre förstå cancerbiologi, tumörprogression och förvärv av resistens mot terapi och dess översättning till effektiva behandlingar, är mänskliga prekliniska modeller som fångar denna cancer heterogenitet ochhierarki viktiga 10,11.
In vitro 2D-cancercelllinjer har använts under lång tid och ger värdefulla insikter om tumörutveckling och de mekanismer som ligger till grund för effekten av terapeutiska molekyler. Deras begränsning med avseende på bristen på fenotypisk och genetisk heterogenitet som finns i de ursprungliga tumörerna är nu allmänt erkänd12. Dessutom reproduceras inte näringsämnen, syre, pH-gradienter och tumörmikromiljön, mikromiljön är särskilt viktig för upprätthållandet av olika celltyper inklusive CSCs11,12. För att övervinna dessa huvudsakliga nackdelar har flera 3D-modeller utvecklats för att experimentellt ta itu med och reproducera cancerns komplexitet och heterogenitet. I själva verket rekapitulerar dessa modeller tumörcellulär heterogenitet, cellcellsinteraktioner och rumslig arkitektur, liknande de som observerats in vivo12,13,14. Primära tumör organoider etablerade från färska tumörer, liksom cellinje-härledda sfäroider, används tillstor del 15,16.
Sfäroider kan odlas på ett byggnadsställningsfritt eller byggnadsställningsbaserat sätt för att tvinga cellerna att bildas och växa i cellaggregat. Byggnadsställningar-fria metoder är baserade på odling av celler under icke-vidhäftande förhållanden (t.ex. hängande droppe-metoden eller ultralåga fästplattor), medan byggnadsställningsbaserade modeller förlitar sig på naturliga, syntetiska eller hybridbiomaterial till odlingsceller12,13,14. Byggnadsställningsbaserade sfäroider uppvisar olika nackdelar eftersom den slutliga sfäroidbildningen beror på arten och sammansättningen av det (bio)material som används. Även om de byggnadsställningsfria sfäroidmetoderna som hittills finns tillgängliga inte förlitar sig på substratets natur, genererar de sfäroider som varierar i struktur och storlek17,18.
Detta arbete syftade till att utforma ett robust och reproducerbart 3D-odlingssystem av sfäroider, som är homogena i storlek, bestående av Caco2 kolon adenocarcinom celler för att studera CSC biologi. Caco2 celler är av särskilt intresse på grund av deras förmåga att skilja övertid 19,20, starkt tyder på en stamliknande potential. Följaktligen visade långsiktiga kultur av sfäroider förekomsten av olika CSC populationer med olika svar på kemoterapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vitro 3D-modeller övervinner de viktigaste experimentella nackdelarna med 2D-cancercellskulturer, eftersom de verkar vara mer tillförlitliga när det gäller att rekapitla typiska tumöregenskaper inklusive mikromiljö och cell heterogenitet. Vanliga 3D-modeller av sfäroider är byggnadsställningar fria (odlade i lågtillsättningsförhållanden) eller byggnadsställningsbaserade (med hjälp av biomaterial till odlingsceller). Dessa metoder uppvisar olika nackdelar eftersom de beror på arten av den byggnadsställ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner bildbehandling och Anipath recherche histologi plattformar (CRCL, CLB). Vi står i skuld till apoteket på Centre Léon Bérard (CLB) Hospital för den snälla gåvan av FOLFOX och FOLFIRI. Vi tackar också Brigitte Manship för kritisk läsning av manuskriptet. Arbetet stöddes av FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) och Av Inca (PLBIO19-289). MVG och LC fick stöd från FRM och CF fick stöd från ARC Foundation och Centre Léon Bérard.
Materials
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | – | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 – Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) – Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) – Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA – Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin – Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
Riferimenti
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Fearon, E. R., Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61 (5), 759-767 (1990).
- Rao, C. V., Yamada, H. Y. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes. Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).
- Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).
- Tran, T. Q., et al. α-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer. Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).
- Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
- Clevers, H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).
- Kawai, S., et al. Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments. Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).
- Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
- Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Weiswald, L. -. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Silva-Almeida, C., Ewart, M. -. A., Wilde, C. 3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).
- Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines. Ricerca sul cancro. 48 (7), 1936-1942 (1988).
- Caro, I., et al. Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).
- Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates. Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).
- Wolpin, B. M., Mayer, R. J. Systemic treatment of colorectal cancer. Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).
- Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).
- Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).
- Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy. World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).
- Jordan, N. J., et al. Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro. Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).
- Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), 59689 (2013).
- Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Nusse, R., Clevers, H. Wnt/β-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
- Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
- Vermeulen, L., Snippert, H. J. Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).
- van der Heijden, M., Vermeulen, L. Stem cells in homeostasis and cancer of the gut. Molecular Cancer. 18 (1), 66 (2019).
- Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs. Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- Potten, C. S., et al. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).
- Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
- Clark, D. W., Palle, K. Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets. Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).
- Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
- Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).
- Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance. Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).
- Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance. Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).
