En tredimensjonal modell av sfæroider for å studere kolonkreft stamceller
Summary
Denne protokollen presenterer et nytt, robust og reproduserbart kultursystem for å generere og vokse tredimensjonale sfæroider fra Caco2 kolon adenokarsinomceller. Resultatene gir det første konseptbeviset for hensiktsmessigheten av denne tilnærmingen for å studere kreft stamcellebiologi, inkludert responsen på kjemoterapi.
Abstract
Kolorektal kreft er preget av heterogenitet og en hierarkisk organisasjon som består av en populasjon av kreftstamceller (CSC) som er ansvarlige for tumorutvikling, vedlikehold og resistens mot narkotika. En bedre forståelse av CSC-egenskaper for deres spesifikke målretting er derfor en forutsetning for effektiv terapi. Imidlertid er det en paucity av egnede kliniske modeller for grundige undersøkelser. Selv om in vitro todimensjonale (2D) kreftcellelinjer gir verdifull innsikt i tumorbiologi, replikerer de ikke fenotypisk og genetisk tumor heterogenitet. Tredimensjonale (3D)-modeller adresserer og reproduserer derimot nærfysiologisk kreftkompleksitet og celle heterogenitet. Målet med dette arbeidet var å designe et robust og reproduserbart 3D-kultursystem for å studere CSC-biologi. Den nåværende metodikken beskriver utvikling og optimalisering av forhold for å generere 3D-sfæroider, som er homogene i størrelse, fra Caco2 kolon adenokarsinomceller, en modell som kan brukes til langsiktig kultur. Viktigst, innenfor sfæroidene ble cellene som ble organisert rundt lumenlignende strukturer, preget av differensialcelleproliferasjonsmønstre og ved tilstedeværelse av CSC-er som uttrykker et panel av markører. Disse resultatene gir det første konseptbeviset for hensiktsmessigheten av denne 3D-tilnærmingen for å studere celle heterogenitet og CSC-biologi, inkludert responsen på kjemoterapi.
Introduction
Kolorektal kreft (CRC) er fortsatt den nest ledende årsaken til kreftrelaterte dødsfall i verden1. Utviklingen av CRC er et resultat av en progressiv oppkjøp og akkumulering av genetiske mutasjoner og / eller epigenetiske endringer2,3, inkludert aktivering av onkogenes og inaktivering av tumordempergener3,4. Videre kan ikke-genetiske faktorer (f.eks. mikromiljøet) bidra til og fremme onkogen transformasjon og dermed delta i utviklingen av CRCs5. Viktigst, CRCer består av forskjellige cellepopulasjoner, inkludert uavklarte CSC-er og bulktumorceller som viser noen differensieringsegenskaper, som utgjør en hierarkisk struktur som minner om organiseringen av epitelet i en normal kolonkrypt6,7.
CSC anses å være ansvarlig for tumorutseende8, vedlikehold og vekst, metastatisk kapasitet og motstand mot konvensjonelle terapier6,7. Innenfor svulster viser kreftceller, inkludert CSC, et høyt nivå av heterogenitet og kompleksitet når det gjelder deres distinkte mutasjons- og epigenetiske profiler, morfologiske og fenotypiske forskjeller, genuttrykk, metabolisme, spredningshastigheter og metastatisk potensial9. Derfor, for bedre å forstå kreftbiologi, tumorprogresjon og oppkjøp av motstand mot terapi og oversettelse til effektive behandlinger, er menneskelige prekliniske modeller som fanger denne kreft heterogeniteten og hierarkiet viktig10,11.
In vitro 2D kreftcellelinjer har blitt brukt i lang tid og gir verdifull innsikt i tumorutvikling og mekanismene som ligger til grunn for effekten av terapeutiske molekyler. Imidlertid er deres begrensning med hensyn til mangelen på fenotypisk og genetisk heterogenitet som finnes i de opprinnelige svulstene nå allment anerkjent12. Videre reproduseres ikke næringsstoffer, oksygen, pH-gradienter og tumormikromiljøet, mikromiljøet er spesielt viktig for vedlikehold av forskjellige celletyper, inkludert CSCer11,12. For å overvinne disse største ulempene har flere 3D-modeller blitt utviklet for å eksperimentelt adressere og reprodusere kompleksiteten og heterogeniteten til kreft. Faktisk recapitulate disse modellene tumor cellulær heterogenitet, cellecelle interaksjoner, og romlig arkitektur, ligner de observerte in vivo12,13,14. Primære tumororganoider etablert fra friske svulster, samt cellelinjeavledede sfæroider, er i stor grad ansatt15,16.
Sfæroider kan dyrkes på en stillasfri eller stillasbasert måte for å tvinge cellene til å danne seg og vokse i cellemengder. Stillasfrie metoder er basert på kulturen til celler under ikke-tilhengerforhold (f.eks. hengende dråpemetode eller ultra-lave festeplater), mens stillasbaserte modeller er avhengige av naturlige, syntetiske eller hybride biomaterialer til kulturceller12,13,14. Stillasbaserte sfæroider presenterer forskjellige ulemper, da den endelige sfæroidformasjonen vil avhenge av arten og sammensetningen av (bio)materialet som brukes. Selv om stillasfrie sfæroidmetoder som er tilgjengelige så langt, ikke er avhengige av substratets natur, genererer de sfæroider som varierer i struktur og størrelse17,18.
Dette arbeidet var rettet mot å designe et robust og reproduserbart 3D-kultursystem av sfæroider, som er homogene i størrelse, sammensatt av Caco2 kolon adenokarsinomceller for å studere CSC-biologi. Caco2 celler er av spesiell interesse på grunn av deres evne til å skille over tid19,20, sterkt antyder et stamcellelignende potensial. Følgelig avslørte sfæroidenes langsiktige kultur tilstedeværelsen av forskjellige CSC-populasjoner med forskjellige svar på kjemoterapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vitro 3D-modeller overvinner de viktigste eksperimentelle ulempene ved 2D kreftcellekulturer, da de ser ut til å være mer pålitelige i å rekapitulere typiske tumorfunksjoner, inkludert mikromiljø og celle heterogenitet. Ofte brukte 3D-modeller av sfæroider er stillasfrie (dyrket i lav-vedleggsforhold) eller stillasbaserte (ved hjelp av biomaterialer til kulturceller). Disse metodene presenterer forskjellige ulemper da de avhenger av stillasets natur som brukes eller gir opphav til sfæroider som er variable i st…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkjenner avbildning og Anipath recherche histologi plattformer (CRCL, CLB). Vi står i gjeld til apoteket til Centre Léon Bérard (CLB) Hospital for den slags gave av FOLFOX og FOLFIRI. Vi takker også Brigitte Manship for kritisk lesning av manuskriptet. Arbeidet ble støttet av FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) og av Inca (PLBIO19-289). MVG og LC fikk støtte fra FRM og CF fikk støtte fra ARC foundation og Centre Léon Bérard.
Materials
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | – | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 – Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) – Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) – Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA – Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin – Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
Riferimenti
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Fearon, E. R., Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61 (5), 759-767 (1990).
- Rao, C. V., Yamada, H. Y. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes. Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).
- Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).
- Tran, T. Q., et al. α-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer. Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).
- Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
- Clevers, H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).
- Kawai, S., et al. Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments. Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).
- Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
- Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Weiswald, L. -. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Silva-Almeida, C., Ewart, M. -. A., Wilde, C. 3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).
- Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines. Ricerca sul cancro. 48 (7), 1936-1942 (1988).
- Caro, I., et al. Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).
- Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates. Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).
- Wolpin, B. M., Mayer, R. J. Systemic treatment of colorectal cancer. Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).
- Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).
- Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).
- Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy. World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).
- Jordan, N. J., et al. Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro. Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).
- Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), 59689 (2013).
- Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Nusse, R., Clevers, H. Wnt/β-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
- Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
- Vermeulen, L., Snippert, H. J. Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).
- van der Heijden, M., Vermeulen, L. Stem cells in homeostasis and cancer of the gut. Molecular Cancer. 18 (1), 66 (2019).
- Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs. Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- Potten, C. S., et al. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).
- Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
- Clark, D. W., Palle, K. Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets. Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).
- Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
- Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).
- Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance. Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).
- Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance. Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).
