Omfattande arbetsflöde för masspektrometribaserade hagelgevärsproteomik av vävnadsprover
Summary
Det beskrivna protokollet ger en optimerad kvantitativ proteomikanalys av vävnadsprover med hjälp av två metoder: etikettbaserad och etikettfri kvantifiering. Etikettbaserade metoder har fördelen av mer exakt kvantifiering av proteiner, medan ett etikettfritt tillvägagångssätt är mer kostnadseffektivt och används för att analysera hundratals prover av en kohort.
Abstract
De senaste framstegen inom masspektrometri har resulterat i djup proteomisk analys tillsammans med generering av robusta och reproducerbara datamängder. Men trots de betydande tekniska framstegen, prov förberedelse från biospecimens såsom patientens blod, CSF och vävnad fortfarande utgör betydande utmaningar. För att identifiera biomarkörer ger vävnadsproteomik ofta en attraktiv provkälla för att översätta forskningsresultat från bänken till kliniken. Det kan avslöja potentiella kandidatbiomarkörer för tidig diagnos av cancer och neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom etc. Vävnadsproteomik ger också en mängd systemisk information baserad på överflöd av proteiner och hjälper till att ta itu med intressanta biologiska frågor.
Kvantitativ proteomikanalys kan grupperas i två breda kategorier: ett etikettbaserat och ett etikettfritt tillvägagångssätt. I det etikettbaserade tillvägagångssättet är proteiner eller peptider märkta med stabila isotoper som SILAC (stabil isotopmärkning med aminosyror i cellkulturen) eller med kemiska taggar som ICAT (isotopkodade affinitetstaggar), TMT (tandemmassetikett) eller iTRAQ (isobarisk tagg för relativ och absolut kvantifiering). Etikettbaserade metoder har fördelen av mer exakt kvantifiering av proteiner och med hjälp av isobariska etiketter kan flera prover analyseras i ett enda experiment. Den etikettfria metoden är ett kostnadseffektivt alternativ till etikettbaserade metoder. Hundratals patientprover som tillhör en viss kohort kan analyseras och jämföras med andra kohorter baserade på kliniska egenskaper. Här har vi beskrivit ett optimerat kvantitativt proteomikarbetsflöde för vävnadsprover med hjälp av etikettfria och etikettbaserade proteomeprofileringsmetoder, vilket är avgörande för tillämpningar inom biovetenskap, särskilt biomarkörupptäcktsbaserade projekt.
Introduction
Proteomikteknik har potential att göra det möjligt att identifiera och kvantifiera potentiella kandidatmarkörer som kan bidra till att upptäcka och prognostifiera sjukdomen1. De senaste framstegen inom masspektrometri har påskyndat klinisk forskning på proteinnivå. Forskare försöker ta itu med utmaningen med komplicerad patobiologi av flera sjukdomar med hjälp av masspektrometribaserad proteomik, som nu erbjuder ökad känslighet för proteinidentifiering och kvantifiering2. Noggrann kvantitativ mätning av proteiner är avgörande för att förstå det dynamiska och rumsliga samarbetet mellan proteiner hos friska och sjuka individer3. En sådan analys i proteomomfattande skala är dock inte lätt.
En stor begränsning av proteomisk profilering av kliniska prover är komplexiteten hos biologiska prover. Många olika typer av prover har undersökts för att studera sjukdomen proteome, såsom cellinjer, plasma ochvävnader 4,5. Cellinjer används ofta som modeller i in vitro-experiment för att efterlikna olika stadier av sjukdomsprogression. En stor begränsning med cellinjer är dock att de enkelt förvärvar genotypiska och fenotypiska förändringar under cellkulturens process6. Kroppsvätskor som plasma kan vara en attraktiv källa för biomarkörupptäckt; Men på grund av de mycket rikliga proteinerna och det dynamiska intervallet av proteinkoncentration är plasmaproteomik lite mer utmanande7. Här kan peptider som härstammar från de mest rikliga proteinerna undertrycka de som härrör från de låga rikliga proteinerna även om massa / laddningsförhållandet är detsamma6. Även om det har gjorts framsteg i utarmnings- och fraktioneringstekniken under de senaste åren, är det fortfarande en stor begränsning av plasmaproteomics8,9. Användningen av vävnader för proteomisk undersökning av sjukdomsbiologi föredras eftersom vävnadsprover är mest proximala för sjukdomsplatserna och erbjuder hög fysiologisk och patologisk information för att ge bättre insikter isjukdomsbiologin 10,11.
I detta manuskript har vi tillhandahållit ett förenklat protokoll för kvantitativ proteomik av vävnadsprover. Vi har använt en buffert som innehåller 8 M urea för vävnad lysat beredning eftersom denna buffert är kompatibel med masspektrometri-baserade undersökningar. Det är dock obligatoriskt att rengöra peptiderna för att ta bort salter innan du injicerar dem i masspektrometern. En viktig punkt att komma ihåg är att minska ureakoncentrationen till mindre än 1 M innan trypsin tillsätts för proteinsammanfattning eftersom trypsin uppvisar låg aktivitet vid 8 M ureakoncentration. Vi har förklarat två metoder för kvantitativ global proteomik: etikettbaserad kvantifiering med iTRAQ (isobariska taggar för relativ och absolut kvantifiering) och etikettfri kvantifiering (LFQ). Den iTRAQ-baserade kvantitativa proteomiken används främst för att jämföra flera prover som varierar i deras biologiska tillstånd (t.ex. normal kontra sjukdom eller behandlade prover). Metoden använder isobaric reagenser för att märka N-terminal primära aminer av peptider12. ITRAQ-reagenserna innehåller en N-metyl piperazin reportergrupp, en balansgrupp och en N-hydroxy succinimide ester grupp som reagerar med N-terminal primära aminer av peptider13. Smälta peptider från varje villkor är märkta med ett visst iTRAQ-reagens. Efter märkningen stoppas reaktionen och märkta peptider från olika förhållanden slås samman till ett enda rör. Denna kombinerade provblandning analyseras med masspektrometer för identifiering och kvantifiering. Efter MS/MS-analysen genereras reporterjonfragment med låga molekylära massor och jonintensiteterna hos dessa reporterjoner används för kvantifiering av proteinerna.
Ett annat tillvägagångssätt, etikettfri kvantifiering används för att bestämma det relativa antalet proteiner i komplexa prover utan att märka peptider med stabila isotoper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vävnadsproteomik av biologiska prover gör det möjligt för oss att utforska nya potentiella biomarkörer associerade med olika stadier av sjukdomsprogression. Det förklarar också mekanismen för signalering och vägar i samband med sjukdomsprogression. Det beskrivna protokollet för vävnad kvantitativ proteomics analys ger reproducerbara bra täckning data. De flesta stegen har anpassats från tillverkarens instruktioner. För att få data av hög kvalitet är följande steg mest avgörande. Därför bör extra fö…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi bekräftar MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), projekt #34_IITB till SS och MASSFIITB Facility vid IIT Bombay med stöd av institutionen för bioteknik (BT/PR13114/INF/22/206/2015) för att utföra alla MS-relaterade experiment.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
Riferimenti
- Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy. Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).
- Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).
- Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).
- Faria, S. S., et al. A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research. Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).
- Chen, E. I., Yates, J. R. Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics. Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).
- Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity. Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).
- Ray, S., et al. Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria. Scientific Reports. 6, 24557 (2016).
- Sharma, S., et al. Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas. Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).
- Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers. Scientific Reports. 4, 7140 (2014).
- Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: Technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
- Rudnick, P. A., et al. A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline. Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).
