Flere metoder har blitt brukt til å analysere plasma lipoproteiner; Imidlertid er ultracentrifugation fortsatt en av de mest populære og pålitelige metodene. Her beskriver vi en metode for hvordan å isolere lipoproteiner fra plasma ved hjelp av sekvensiell tetthet ultracentrifugation og hvordan å analysere apolipoproteiner for både diagnostiske og forskningsformål.
Analyse av plasma lipoproteiner og apolipoproteiner er en viktig del for diagnostisering av dyslipidemi og studier av lipidmetabolisme og aterosklerose. Selv om det finnes flere metoder for å analysere plasma lipoproteiner, ultracentrifugation er fortsatt en av de mest populære og pålitelige metoder. På grunn av sin intakte separasjonsprosedyre kan lipoproteinfraksjonene isolert ved denne metoden brukes til analyse av lipoproteiner, apolipoproteiner, proteomer og funksjonell studie av lipoproteiner med kultiverte celler in vitro. Her gir vi en detaljert protokoll for å isolere syv lipoproteinfraksjoner, inkludert VLDL (d<1,006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), LDLs (d=1,04 og 1,06 g/ml), HDLer (d=1,08, 1,10 og 1,21 g/ml) fra kaninplasma ved hjelp av sekvensiell flytende ultracentrifugation. I tillegg introduserer vi leserne hvordan de analyserer apolipoproteiner som apoA-I, apoB og apoE av SDS-PAGE og Western blotting og viser representative resultater av lipoprotein og apolipoproteinprofiler ved hjelp av hyperlipidemiske kaninmodeller. Denne metoden kan bli en standardprotokoll for både klinikere og grunnleggende forskere for å analysere lipoproteinfunksjoner.
Dyslipidemi er den viktigste risikofaktoren for aterosklerotisk sykdom i verden. Høye nivåer av lipoproteiner med lav tetthet (LDLer) og lave nivåer av lipoproteiner med høy tetthet (HDLer) er nært forbundet med høy risiko for koronar hjertesykdom (CHD)1,2. I klinisk setting måles både LDL-kolesterol (LDL-C) og HDL-kolesterol (HDL-C) rutinemessig ved hjelp av en automatisert analysator i et klinisklaboratorium 3,4. Til tross for dette er det viktig å analysere lipoproteinprofiler i detaljer for diagnostisering av dyslipidemi og studiet av lipidmetabolisme og aterosklerose hos menneskelige og eksperimentelle dyr. Flere metoder har blitt rapportert å analysere plasma lipoproteiner som ultracentrifugation, størrelse eksklusjon kromatografi [rask protein flytende kromatografi (FPLC) og høy ytelse flytende kromatografi (HPLC)], elektroforese av agarose og polyakrylamid geler, kjernemagnetisk resonans, og selektiv kjemisk nedbør ved hjelp av polyanioner og divalente kationer eller andre kjemikalier. På 1950-tallet foreslo Havels gruppe først begrepet lipoproteiner definert av tettheter ved hjelp av ultracentrifugation og klassifisert dem i chylomicrons (CM), svært lav tetthet lipoproteiner (VLDL), mellomliggende tetthet lipoproteiner (IDL), LDL, og HDL5 og senere, metoden ble ytterligere endret av andregrupper 6,7. Inntil nå er ultracentrifugation den mest populære og pålitelige metoden, mens den praktiske protokollen fortsatt ikke er tilgjengelig. I dette papiret forsøkte vi å beskrive en brukervennlig protokoll for å isolere en liten skala av plasma ved hjelp av sekvensiell tetthet flytende ultracentrifugation opprinnelig beskrevet tidligere8. Isolering av syv plasma lipoproteinfraksjoner [VLDL (d<1,006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), LDLer (d=1,04 og 1,06 g/ml), HDLer (d=1,08, 1,10 og 1,21 g/ml)] gjør det mulig for forskere å gjøre en omfattende analyse av både lipoproteiner og deres kompositoriske apolipoproteiner9,10,11. De intakte syv påfølgende tetthet lipoproteiner kan brukes til å analysere lipoprotein funksjoner og også tjene til celle-baserte in vitro strategier. Denne protokollen bør være nyttig for både klinisk diagnose og grunnleggende forskning. Her brukte vi kaninplasma som et eksempel for å demonstrere denne teknikken, mens plasma fra andre arter kan brukes på samme måte.
Hyperlipidemi er en av de viktigste risikofaktorene for aterosklerotisk sykdom. Dermed er analyse av plasma lipoproteiner ikke bare avgjørende for diagnostisering av dyslipidemipasienter, men også viktig for undersøkelse av molekylære mekanismer for lipoproteinmetabolisme og aterosklerose. I denne studien beskrev vi protokollen for isolasjon og analyse av plasmalipoproteiner som kan brukes i laboratoriene der ultracentrifugation er tilgjengelig. Informasjon innhentet av denne metoden er omfattende og grei derfor anbe…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis støttet av et forskningstilskudd fra JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, National Natural Science Foundation of China (nr. 81941001 og 81770457), JSPS-CAS under Japan-China Research Cooperative Program.
22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
Rotor | HITACHI | T15A43 | |
SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |