अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा प्लाज्मा लिपोप्रोटीन का अलगाव और विश्लेषण
Summary
प्लाज्मा लिपोप्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया गया है; हालांकि, अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन अभी भी सबसे लोकप्रिय और विश्वसनीय तरीकों में से एक है। यहां, हम अनुक्रमिक घनत्व अल्ट्रासेफगेशन का उपयोग करके प्लाज्मा से लिपोप्रोटीन को अलग करने के तरीके के बारे में एक विधि का वर्णन करते हैं और नैदानिक और अनुसंधान दोनों उद्देश्यों के लिए एप्रिपोप्रोटीन का विश्लेषण कैसे करें।
Abstract
प्लाज्मा लिपोप्रोटीन और एपोलिपोप्रोटीन का विश्लेषण डिस्लिपिडेमिया के निदान और लिपिड मेटाबोलिज्म और एथेरोस्क्लेरोसिस के अध्ययन के लिए एक आवश्यक हिस्सा है। हालांकि प्लाज्मा लिपोप्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए कई तरीके हैं, अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन अभी भी सबसे लोकप्रिय और विश्वसनीय तरीकों में से एक है। इसकी अक्षुण्ण पृथक्करण प्रक्रिया के कारण, इस विधि से अलग लिपोप्रोटीन अंशों का उपयोग विट्रो में सुसंस्कृत कोशिकाओं के साथ लिपोप्रोटीन, एपोलिपोप्रोटीन, प्रोटियोम्स और लिपोप्रोटीन के कार्यात्मक अध्ययन के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। यहां, हम वीएलडीएल (डीएंड एलटी;1.006 जी/एमएल), आईडीएल (d=1.02 g/mL), एलडीएल (d=1.04 और 1.06 g/mL), एचडीएल (d=1.08, सहित सात लिपोप्रोटीन अंशों को अलग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं अनुक्रमिक फ्लोटिंग अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन का उपयोग करके खरगोश प्लाज्मा से 1.10, और 1.21 ग्राम/एमएल)। इसके अलावा, हम पाठकों को एसडीएस-पेज और वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा एपोए-1, एपोब और एपोई जैसे एपिपोपॉपरिन का विश्लेषण करने का तरीका पेश करते हैं और हाइपरलिपिडेमिक खरगोश मॉडल का उपयोग करके लिपोप्रोटीन और एपोलीपोप्रोटीन प्रोफाइल के प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं। यह विधि चिकित्सकों और बुनियादी वैज्ञानिकों दोनों के लिए लिपोप्रोटीन कार्यों का विश्लेषण करने के लिए एक मानक प्रोटोकॉल बन सकती है।
Introduction
डिस्लिपिडेमिया दुनिया में एथेरोस्क्लेरोटिक बीमारी का प्रमुख जोखिम कारक है। कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एलडीएल) के उच्च स्तर और उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एचडीएलएस) का निम्न स्तर कोरोनरी हृदय रोग (सीएचडी)1,2के उच्च जोखिम से निकटता से जुड़ा हुआ है। नैदानिक सेटिंग में, एलडीएल-कोलेस्ट्रॉल (एलडीएल-सी) और एचडीएल-कोलेस्ट्रॉल (एचडीएल-सी) दोनों को नियमित रूप से नैदानिक प्रयोगशाला3, 4में स्वचालित एनालाइजर का उपयोग करके मापाजाताहै। इसके बावजूद, डिस्लिपिडेमिया के निदान और मानव और प्रयोगात्मक जानवरों में लिपिड मेटाबोलिज्म और एथेरोस्क्लेरोसिस के अध्ययन के लिए विवरण में लिपोप्रोटीन प्रोफाइल का विश्लेषण करना आवश्यक है। प्लाज्मा लिपोप्रोटीन जैसे अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन, साइज अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी [फास्ट प्रोटीन लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (एफपीएलसी) और हाई परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी)], एगर उठे और पॉलीएक्रीलामाइड जैल, न्यूक्लियर मैग्नेटिक रेक्शन, और पॉलीएक्रिमेशन या अन्य रसायनों का इस्तेमाल करते हुए चुनिंदा केमिकल बिहेवियर्स का विश्लेषण करने के लिए कई तरीकों की जानकारी दी गई है । 1 9 50 के दशक में, हैवेल के समूह ने पहले अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन का उपयोग करके घनत्व द्वारा परिभाषित लिपोप्रोटीन की अवधारणा का प्रस्ताव किया और उन्हें कालोमिक्स्रॉन (सीएम), बहुत कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (वीएलडीएल), मध्यवर्ती-घनत्व लिपोप्रोटीन (आईडीएल), एलडीएल और एचडीएल5 में वर्गीकृत किया गया और बाद में, विधि को अन्य समूहों द्वारा संशोधित किया गया6,77. अब तक, अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन सबसे लोकप्रिय और विश्वसनीय तरीका है जबकि व्यावहारिक प्रोटोकॉल अभी भी उपलब्ध नहीं है। इस पेपर में, हमने अनुक्रमिक घनत्व फ्लोटिंग अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन का उपयोग करके प्लाज्मा के छोटे पैमाने को अलग करने के लिए एक आसान-से-उपयोग प्रोटोकॉल का वर्णन करने का प्रयास किया मूल रूप से पहले8वर्णित है। सात प्लाज्मा लिपोप्रोटीन अंशों का अलगाव [वीएलडीएल (डीएंड एलटी;1.006 जी/एमएल), आईडीएल (डी = 1.02 जी/एमएल), एलडीएल (डी = 1.04 और 1.06 जी/एमएल), एचडीएल (डी=1.08, 1.10, और 1.21 ग्राम/एमएल)] शोधकर्ताओं को लिपोप्रोटीनऔर उनके रचनात्मक अपोलिपोप्रोटीन9,10, 11दोनों का व्यापक विश्लेषण करने में सक्षम बनाता है। बरकरार सात लगातार घनत्व लिपोप्रोटीन का उपयोग लिपोप्रोटीन कार्यों का विश्लेषण करने और सेल-आधारित इन विट्रो रणनीतियों में सेवा करने के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल नैदानिक निदान और बुनियादी अनुसंधान दोनों के लिए उपयोगी होना चाहिए। यहां हमने इस तकनीक को प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में खरगोश प्लाज्मा का उपयोग किया जबकि अन्य प्रजातियों से प्लाज्मा को उसी तरह लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हाइपरलिपिडेमिया एथेरोस्क्लेरोटिक रोग के सबसे महत्वपूर्ण जोखिम कारकों में से एक है। इस प्रकार, प्लाज्मा लिपोप्रोटीन का विश्लेषण न केवल डिस्लिपिडेमिया रोगियों के निदान के लिए आवश्यक है बल्कि लिपोप्?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को जापान-चीन अनुसंधान सहकारी कार्यक्रम के तहत जेएसपीएस काकेंही ग्रांट नंबर जेपी 20K08858, नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (नंबर 81941001 और 81770457), जेएसपीएस-कैस से एक शोध अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
Riferimenti
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