超遠心分離による血漿リポタンパク質の単離と分析
Summary
血漿リポタンパク質の分析にはいくつかの方法が使用されています。しかし、超遠心は依然として最も人気があり、信頼性の高い方法の1つです。ここでは、逐次密度超遠心を用いて血漿からリポタンパク質を分離する方法と、診断と研究の両方の目的でアポリポタンパク質を分析する方法について説明する。
Abstract
血漿リポタンパク質とアポリポタンパク質の分析は、脂質異常症の診断や脂質代謝とアテローム性動脈硬化症の研究に不可欠な部分です。血漿リポタンパク質を分析するためのいくつかの方法がありますが、超遠心分離は依然として最も人気があり、信頼性の高い方法の1つです。その無傷の分離手順のために、この方法によって単離されたリポタンパク質の画分は、リポタンパク質、アポリポタンパク質、プロテオーム、および培養細胞を有するリポタンパク質の機能研究に使用することができる。ここでは、VLDL(d<1.006 g/mL)、IDL(d=1.02 g/mL)、LL(d=1.04および1.06 g/mL)、HDL(d=1.08、1.10、および1.21 g/mL)を含む7つのリポタンパク質画分をシーケンシャルプラズマを使用してシーケンシャルプラズマから分離するための詳細なプロトコルを提供します。また、SDS-PAGEやウエスタンブロッティングによるアポアI、apoB、apoEなどのアポリポタンパク質を分析する方法を読者に紹介し、過脂性ウサギモデルを用いたリポタンパク質およびアポリポタンパク質プロファイルの代表的な結果を示します。この方法は、臨床医と基本的な科学者の両方がリポタンパク質機能を分析するための標準的なプロトコルになることができます。
Introduction
脂質異常症は、世界の動脈硬化性疾患の主要な危険因子です。高濃度の低密度リポタンパク質(LDL)および低濃度の高密度リポタンパク質(HDL)は、冠状動脈性心疾患(CHD)1,2の高リスクと密接に関連している。臨床現場では、LDLコレステロール(LDL-C)とHDL-コレステロール(HDL-C)の両方が臨床検査室3,4の自動分析装置を用いて日常的に測定される。しかし、脂質異常症の診断やヒトおよび実験動物における脂質代謝とアテローム性動脈硬化症の研究については、リポタンパク質のプロファイルを詳細に分析することが不可欠です。超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー(高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、アガロースおよびポリアクリルアミドゲルによる電気泳動、核磁気共鳴、ポリアニオンおよび二価カチオンなどの選択的化学沈殿を分析する方法がいくつか報告されている。1950年代、Havelのグループは、最初に超遠心分離を使用して密度によって定義されるリポタンパク質の概念を提案し、それらをチロミクロン(CM)、非常に低密度リポタンパク質(VLDL)、中間密度リポタンパク質(IDL)、LDL、およびHDL5以降に分類し、この方法は他のグループ6、7によってさらに改変された。これまで、超遠心分離は最も一般的で信頼性の高い方法ですが、実用的なプロトコルはまだ利用できません。本稿では、先に説明した逐次密度の超遠心分離を用いて、微小なプラズマを単離するための使いやすいプロトコルを説明することを試みた。7つの血漿リポタンパク質画分の単離 [VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LL (d=1.04 および 1.06 g/mL), HDL (d=1.08, 1.10、および1.21 g/mL))は、研究者がリポタンパク質とその組成アポリポタンパク質9、10、11の両方の広範な分析を行うことを可能にする。無傷の7つの連続した密度リポタンパク質は、リポタンパク質機能を分析し、また細胞ベースのインビトロ戦略にも役立つことができます。このプロトコルは、臨床診断と基礎研究の両方に有用である必要があります。ここでは、他の種からのプラズマを同じように適用しながら、この技術を実証するために、例としてウサギのプラズマを使用しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
高脂血症は、アテローム硬化性疾患の最も重要な危険因子の1つです。したがって、血漿リポタンパク質の解析は、脂質異常症患者の診断に不可欠であるだけでなく、リポタンパク質代謝およびアテローム性動脈硬化症の分子機構の研究にも重要である。本研究では、超遠心分離が可能な研究室で適用できる血漿リポタンパク質の単離および分析のプロトコルについて説明した。この方法で得…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、日中研究協同プログラムのJSPS-CASである中国国立自然科学財団(第81941001、81770457)であるJSPS KAKENHIグラント番号JP 20K08858の研究助成金の一部によって支援されました。
Materials
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
Riferimenti
- Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
- Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
- Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
- Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
- Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
- Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
- Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
- Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
- Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
- Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
- Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
- Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
- Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
- von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
- Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
- Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
- De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
- Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).
