Isolasjon og analyse av plasmalipoproteiner ved ultracentrifugation

Summary

Flere metoder har blitt brukt til å analysere plasma lipoproteiner; Imidlertid er ultracentrifugation fortsatt en av de mest populære og pålitelige metodene. Her beskriver vi en metode for hvordan å isolere lipoproteiner fra plasma ved hjelp av sekvensiell tetthet ultracentrifugation og hvordan å analysere apolipoproteiner for både diagnostiske og forskningsformål.

Abstract

Analyse av plasma lipoproteiner og apolipoproteiner er en viktig del for diagnostisering av dyslipidemi og studier av lipidmetabolisme og aterosklerose. Selv om det finnes flere metoder for å analysere plasma lipoproteiner, ultracentrifugation er fortsatt en av de mest populære og pålitelige metoder. På grunn av sin intakte separasjonsprosedyre kan lipoproteinfraksjonene isolert ved denne metoden brukes til analyse av lipoproteiner, apolipoproteiner, proteomer og funksjonell studie av lipoproteiner med kultiverte celler in vitro. Her gir vi en detaljert protokoll for å isolere syv lipoproteinfraksjoner, inkludert VLDL (d<1,006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), LDLs (d=1,04 og 1,06 g/ml), HDLer (d=1,08, 1,10 og 1,21 g/ml) fra kaninplasma ved hjelp av sekvensiell flytende ultracentrifugation. I tillegg introduserer vi leserne hvordan de analyserer apolipoproteiner som apoA-I, apoB og apoE av SDS-PAGE og Western blotting og viser representative resultater av lipoprotein og apolipoproteinprofiler ved hjelp av hyperlipidemiske kaninmodeller. Denne metoden kan bli en standardprotokoll for både klinikere og grunnleggende forskere for å analysere lipoproteinfunksjoner.

Introduction

Dyslipidemi er den viktigste risikofaktoren for aterosklerotisk sykdom i verden. Høye nivåer av lipoproteiner med lav tetthet (LDLer) og lave nivåer av lipoproteiner med høy tetthet (HDLer) er nært forbundet med høy risiko for koronar hjertesykdom (CHD)^1,2. I klinisk setting måles både LDL-kolesterol (LDL-C) og HDL-kolesterol (HDL-C) rutinemessig ved hjelp av en automatisert analysator i et klinisk^{laboratorium 3,4}. Til tross for dette er det viktig å analysere lipoproteinprofiler i detaljer for diagnostisering av dyslipidemi og studiet av lipidmetabolisme og aterosklerose hos menneskelige og eksperimentelle dyr. Flere metoder har blitt rapportert å analysere plasma lipoproteiner som ultracentrifugation, størrelse eksklusjon kromatografi [rask protein flytende kromatografi (FPLC) og høy ytelse flytende kromatografi (HPLC)], elektroforese av agarose og polyakrylamid geler, kjernemagnetisk resonans, og selektiv kjemisk nedbør ved hjelp av polyanioner og divalente kationer eller andre kjemikalier. På 1950-tallet foreslo Havels gruppe først begrepet lipoproteiner definert av tettheter ved hjelp av ultracentrifugation og klassifisert dem i chylomicrons (CM), svært lav tetthet lipoproteiner (VLDL), mellomliggende tetthet lipoproteiner (IDL), LDL, og HDL⁵ og senere, metoden ble ytterligere endret av andre^{grupper 6,7}. Inntil nå er ultracentrifugation den mest populære og pålitelige metoden, mens den praktiske protokollen fortsatt ikke er tilgjengelig. I dette papiret forsøkte vi å beskrive en brukervennlig protokoll for å isolere en liten skala av plasma ved hjelp av sekvensiell tetthet flytende ultracentrifugation opprinnelig beskrevet tidligere⁸. Isolering av syv plasma lipoproteinfraksjoner [VLDL (d<1,006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), LDLer (d=1,04 og 1,06 g/ml), HDLer (d=1,08, 1,10 og 1,21 g/ml)] gjør det mulig for forskere å gjøre en omfattende analyse av både lipoproteiner og deres kompositoriske apolipoproteiner^9,10,11. De intakte syv påfølgende tetthet lipoproteiner kan brukes til å analysere lipoprotein funksjoner og også tjene til celle-baserte in vitro strategier. Denne protokollen bør være nyttig for både klinisk diagnose og grunnleggende forskning. Her brukte vi kaninplasma som et eksempel for å demonstrere denne teknikken, mens plasma fra andre arter kan brukes på samme måte.

Protocol

Alle prosedyrer for kaninstudier ble utført med godkjenning av University of Yamanashi Institutional Animal Care and Use Committee (Godkjent nummer: A28-39). 1. Plasmaseparasjon fra kaninblod Forbered 1,5 ml mikrorør som inneholder 15 μL på 0,5 M EDTA (pH 8,0) for blodinnsamling. Sett en kanin i et begrensningsmiddel og punkter en auricular mellomarterie ved hjelp av en 22 gauge nål og samle blod inn i et rør. Bland blodet forsiktig med EDTA og legg dem på is. …

Representative Results

Ved hjelp av denne protokollen isolerte vi kaninlipoproteiner ved hjelp av 1 ml plasma og fikk syv tetthetsfraksjoner. Isolerte tetthetsfraksjoner er nok til å måle lipider og apolipoproteiner som beskrevet ovenfor for de fleste forskningsformål. Den samme prosedyren kan også brukes til å isolere plasma lipoproteiner fra mennesker og andre arter. For små dyr som mus er det nødvendig med samlet plasma. Figur 3 viser lipoprotein profiler av vill-type (WT) kaniner matet enten en normal s…

Discussion

Hyperlipidemi er en av de viktigste risikofaktorene for aterosklerotisk sykdom. Dermed er analyse av plasma lipoproteiner ikke bare avgjørende for diagnostisering av dyslipidemipasienter, men også viktig for undersøkelse av molekylære mekanismer for lipoproteinmetabolisme og aterosklerose. I denne studien beskrev vi protokollen for isolasjon og analyse av plasmalipoproteiner som kan brukes i laboratoriene der ultracentrifugation er tilgjengelig. Informasjon innhentet av denne metoden er omfattende og grei derfor anbe…

Materials

22-gauge needle	Terumo	NN-2232S	For blood collection
96-well microplate	greiner bio-one	655101	For lipids measurment
Anti-apolipoprotein A-I antibody	LifeSpan BioSciences	LS-C314186	For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein B antibody	ROCKLAND	600-101-111	For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein E antibody	Merck Millipore	AB947	For Western blottng, use 1:1,000
CBB staining kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	299-50101	For apolipoprotein analysis
Centrifuge	HITACHI		himac CF15RN
Closure	Spectrum	132736	For lipoprotein dialysis
Dialysis tubing	FUJIFILM Wako Pure Chemical	043-30921	For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000
Dry heat block	Major Science	MD-01N	For SDS-PAGE sample preparation
ECL Western blotting detection reagents	GE Healthcare	RPN2209	For Western blotting
Electrophoresis Chamber	BIO-RAD		Mini-PROTEAN Tetra Cell
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	345-01865	For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)
Filter paper	ADVANTEC	590	For Western blotting
Fixed angle ultracentrifuge rotor	BECKMAN COULTER	357656	TLA-120.2
Fixing solution			For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)
Immun-Blot PVDF menbrane	BIO-RAD	1620177	For Western blotting
Lumino image analyzer	GE Healthcare		For Western blotting, ImageQuant LAS 4000
Magnetic stirrer	ADVANTEC	SR-304	For lipoprotein dialysis
Microplate reader iMARK	BIO-RAD		For lipids measurment
Microtube	INA-OPTIKA	SC-0150
Orbital agitator USBDbo	Stovall Life Science
Peroxidase congugated anti goat IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	705-035-003	For Western blotting, use 1:2,000
Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	715-035-150	For Western blotting, use 1:2,000
Phospholipids assay kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	433-36201	For lipids measurment
Polycarbonate ultracentrifuge Tubes	BECKMAN COULTER	343778
Potassium Bromide	FUJIFILM Wako Pure Chemical	168-03475	For density solution
Power Supply	BIO-RAD		For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC
Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra	BIO-RAD	161-0377	For SDS-PAGE and Western blotting
Rabbit restrainer	Natsume Seisakusho	KN-318	For blood collection
Rotor	HITACHI		T15A43
SDS-PAGE running buffer			25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS
SDS-PAGE sample buffer (2x)			0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol
SDS-polyacrylamide gel			4-20% gradient polyacrylamide gel
Skim milk powder	FUJIFILM Wako Pure Chemical	190-12865	For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)
Total cholesterol assay kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	439-17501	For lipids measurment
Triglyicerides assay kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	432-40201	For lipids measurment
Tube slicer for thick-walled tube	BECKMAN COULTER	347960	For lipoprotein isolation
Tween 20	SIGMA-ALDRICH	P1379	For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)
Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	A95761	Optima MAX-TL
Western blotting wet transfer system	BIO-RAD		Mini Trans-Blot Cell