Aislamiento y análisis de lipoproteínas plasmáticas por ultracentrifugación
Summary
Se han utilizado varios métodos para analizar lipoproteínas plasmáticas; sin embargo, ultracentrifugación sigue siendo uno de los métodos más populares y confiables. Aquí, describimos un método con respecto a cómo aislar las lipoproteínas del plasma utilizando ultracentrifugación de densidad secuencial y cómo analizar las apolipoproteínas con fines diagnósticos y de investigación.
Abstract
El análisis de lipoproteínas plasmáticas y apolipoproteínas es una parte esencial para el diagnóstico de dislipidemia y estudios de metabolismo lipídico y aterosclerosis. Aunque hay varios métodos para analizar lipoproteínas plasmáticas, ultracentrifugación sigue siendo uno de los métodos más populares y fiables. Debido a su procedimiento de separación intacto, las fracciones de lipoproteína aisladas por este método se pueden utilizar para el análisis de lipoproteínas, apolipoproteínas, proteomas, y estudio funcional de lipoproteínas con células cultivadas in vitro. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para aislar siete fracciones de lipoproteína incluyendo VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), PMA (d=1.04 y 1.06 g/mL), HDL (d=1.08, 1.10, y 1.21 g/mL) de plasma de conejo utilizando ultracentrifugación flotante secuencial. Además, presentamos a los lectores cómo analizar apolipoproteínas como apoA-I, apoB y apoE por SDS-PAGE y Western blotting y mostrar resultados representativos de perfiles de lipoproteína y apolipoproteína utilizando modelos de conejo hiperlipidémico. Este método puede convertirse en un protocolo estándar para que tanto los médicos como los científicos básicos analicen las funciones de lipoproteína.
Introduction
La dislipidemia es el principal factor de riesgo de la enfermedad aterosclerótica en el mundo. Los altos niveles de lipoproteínas de baja densidad (PMA) y los bajos niveles de lipoproteínas de alta densidad (HDL) están estrechamente asociados con un alto riesgo de enfermedad coronaria (CHD)1,2. En el entorno clínico, tanto el colesterol LDL (LDL-C) como el colesterol HDL (HDL-C) se miden rutinariamente utilizando un analizador automatizado en un laboratorio clínico3,4. A pesar de esto, es esencial analizar los perfiles de lipoproteína en detalle para el diagnóstico de dislipidemia y el estudio del metabolismo lipídico y la aterosclerosis en animales humanos y experimentales. Se han notificado varios métodos para analizar lipoproteínas plasmáticas como ultracentrifugación, cromatografía de exclusión de tamaño [cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC) y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)], electroforesis por agarose y geles de poliacrilamida, resonancia magnética nuclear y precipitación química selectiva utilizando polianiones y cálculos divalentes u otros productos químicos. En la década de 1950, el grupo de Havel propuso por primera vez el concepto de lipoproteínas definidas por densidades utilizando ultracentrifugación y las clasificó en chylomicrons (CM), lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de densidad intermedia (IDL), LDL y HDL5 y posteriores, el método fue modificado por otros grupos6,7. Hasta ahora, ultracentrifugación es el método más popular y fiable, mientras que el protocolo práctico todavía no está disponible. En este artículo, intentamos describir un protocolo fácil de usar para aislar una pequeña escala de plasma utilizando ultracentrifugación flotante de densidad secuencial descrita originalmente anteriormente8. Aislamiento de siete fracciones plasmáticas de lipoproteína [VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), PMA (d=1.04 y 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1.10, y 1.21 g/mL)] permite a los investigadores hacer un análisis exhaustivo de las lipoproteínas y sus apolipoproteínas composicionales9,10,11. Las lipoproteínas intactas de siete densidades consecutivas se pueden utilizar para analizar las funciones de lipoproteína y también servir para estrategias in vitro basadas en células. Este protocolo debe ser útil tanto para el diagnóstico clínico como para la investigación básica. Aquí usamos plasma de conejo como ejemplo para demostrar esta técnica, mientras que el plasma de otras especies se puede aplicar de la misma manera.
Protocol
Representative Results
Discussion
La hiperlipidemia es uno de los factores de riesgo más importantes de la enfermedad aterosclerótica. Por lo tanto, el análisis de lipoproteínas plasmáticas no sólo es esencial para el diagnóstico de pacientes con dislipidemia, sino también importante para la investigación de mecanismos moleculares del metabolismo de la lipoproteína y la aterosclerosis. En este estudio, describimos el protocolo de aislamiento y análisis de lipoproteínas plasmáticas que se pueden aplicar en los laboratorios donde hay ultracent…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por una beca de investigación de JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81941001 y 81770457), JSPS-CAS bajo el Programa Cooperativo de Investigación Japón-China.
Materials
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
Riferimenti
- Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
- Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
- Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
- Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
- Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
- Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
- Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
- Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
- Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
- Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
- Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
- Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
- Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
- von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
- Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
- Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
- De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
- Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).
