Plazma Lipoproteinlerinin Ultracentrifugation ile İzolasyonu ve Analizi
Summary
Plazma lipoproteinlerinin analizi için çeşitli yöntemler kullanılmıştır; ancak, ultrasantrifüjleme hala en popüler ve güvenilir yöntemlerden biridir. Burada, sıralı yoğunluklu ultrasantrifüjasyon kullanarak lipoproteinlerin plazmadan nasıl izole edilmesi ve apolipoproteinlerin hem tanı hem de araştırma amacıyla nasıl analiz edilmesi ile ilgili bir yöntem açıklıyoruz.
Abstract
Plazma lipoproteinlerinin ve apolipoproteinlerin analizi dislipidemi tanısı ve lipid metabolizması ve ateroskleroz çalışmaları için önemli bir parçadır. Plazma lipoproteinlerini analiz etmek için çeşitli yöntemler olmasına rağmen, ultrasantrifüjleme hala en popüler ve güvenilir yöntemlerden biridir. Bozulmamış ayırma prosedürü nedeniyle, bu yöntemle izole edilen lipoprotein fraksiyonları, lipoproteinlerin, apolipoproteinlerin, proteomların analizi ve kültürlü hücreler in vitro ile lipoproteinlerin fonksiyonel çalışması için kullanılabilir. Burada, VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDL'ler (d=1.04 ve 1.06 g/mL), HDL'ler (d=1.08, 1.10 ve 1.21 g/mL) sıralı yüzer ultrasantrifüj kullanarak tavşan plazmasından. Buna ek olarak, okuyuculara SDS-PAGE ve Western blotting tarafından apoA-I, apoB ve apoE gibi apolipoproteinlerin nasıl analiz edeceğimizi tanıtıyoruz ve hiperlipidemik tavşan modellerini kullanarak lipoprotein ve apolipoprotein profillerinin temsili sonuçlarını gösteriyoruz. Bu yöntem hem klinisyenler hem de temel bilim adamları için lipoprotein fonksiyonlarını analiz etmek için standart bir protokol haline gelebilir.
Introduction
Dislipidemi dünyada aterosklerotik hastalığın başlıca risk faktörüdür. Yüksek düzeyde düşük yoğunluklu lipoproteinler (LDL’ler) ve düşük yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL’ ler) yüksek koroner kalp hastalığı riski (CHD)1,2ile yakından ilişkilidir. Klinik ortamda, hem LDL-kolesterol (LDL-C) hem de HDL-kolesterol (HDL-C) rutin olarak bir klinik laboratuvarda otomatik bir analizör kullanılarak ölçülür3,4. Buna rağmen, dislipidemi tanısı ve insan ve deney hayvanlarında lipid metabolizması ve ateroskleroz çalışması için lipoprotein profillerini ayrıntılı olarak analiz etmek önemlidir. Ultrasantrifüjasyon, boyut dışlama kromatografisi [hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC)], agarose ve poliakrilamid jeller tarafından elektroforez, nükleer manyetik rezonans ve seçici kimyasal çökeltme gibi plazma lipoproteinlerini polianyonlar ve divalent katyonlar veya diğer kimyasallar kullanılarak analiz etmek için çeşitli yöntemler bildirilmiştir. 1950’lerde Havel’in grubu ilk olarak ultrasantrifüjleme kullanan yoğunluklar tarafından tanımlanan lipoprotein kavramını önerdi ve bunları chylomicrons (CM), çok düşük yoğunluklu lipoproteinler (VLDL), orta yoğunluklu lipoproteinler (IDL), LDL ve HDL5 ve daha sonra diğer gruplar tarafından daha da değiştirildi6,7. Şimdiye kadar, ultrasantrifüjleme en popüler ve güvenilir yöntemdir, ancak pratik protokol hala mevcut değildir. Bu yazıda, başlangıçta daha önce açıklanan sıralı yoğunluklu yüzer ultrasantrifüjasyon kullanarak küçük bir plazma ölçeğini izole etmek için kullanımı kolay bir protokol tanımlamaya çalıştık8. Yedi plazma lipoprotein fraksiyonunun izolasyonu [VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDL'ler (d=1.04 ve 1.06 g/mL), HDL'ler (d=1.08, 1.10 ve 1.21 g/mL)] araştırmacıların hem lipoproteinlerin hem debunlarınbileşimsel apolipoproteinleri 9 , 10,11’inkapsamlı bir analizini yapmasını sağlar. Sağlam yedi ardışık yoğunluklu lipoprotein, lipoprotein fonksiyonlarını analiz etmek ve ayrıca hücre bazlı in vitro stratejilere hizmet etmek için kullanılabilir. Bu protokol hem klinik tanı hem de temel araştırmalar için yararlı olmalıdır. Burada tavşan plazmasını örnek olarak diğer türlerden alınan plazma aynı şekilde uygulanabilirken bu tekniği göstermek için kullandık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hiperlipidemi aterosklerotik hastalığın en önemli risk faktörlerinden biridir. Bu nedenle, plazma lipoproteinlerinin analizi sadece dislipidemi hastalarının tanısı için değil, aynı zamanda lipoprotein metabolizması ve aterosklerozun moleküler mekanizmalarının araştırılması için de önemlidir. Bu çalışmada ultrasantrifüjasyonun mevcut olduğu laboratuvarlarda uygulanabilen plazma lipoproteinlerinin izolasyon ve analiz protokolünü anlattık. Bu yöntemle elde edilen bilgiler kapsamlı ve basittir…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen JSPS KAKENHI’nin JP 20K08858, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81941001 ve 81770457), Japonya-Çin Araştırma Kooperatifi Programı kapsamında JSPS-CAS’tan aldığı araştırma hibeleri ile desteklendi.
Materials
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
Riferimenti
- Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
- Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
- Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
- Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
- Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
- Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
- Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
- Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
- Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
- Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
- Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
- Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
- Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
- von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
- Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
- Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
- De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
- Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).
