Duas abordagens citométricas de fluxo de detecção de superfície de ligante NKG2D para distinguir células-tronco de subpopulações a granel em leucemia mielóide aguda
Summary
Apresentamos dois protocolos de coloração diferentes para detecção de ligantes NKG2D (NKG2DL) em amostras de leucemia mielóide aguda primária humana (LMA). A primeira abordagem é baseada em uma proteína de fusão, capaz de reconhecer todos os ligantes conhecidos e potencialmente ainda desconhecidos, enquanto o segundo protocolo conta com a adição de múltiplos anticorpos anti-NKG2DL.
Abstract
Dentro do mesmo paciente, a ausência de ligantes NKG2D (NKG2DL) expressão superficial foi demonstrada para distinguir subpopulações leucêmicas com propriedades de células-tronco (chamadas células-tronco leucêmicas, LSCs) de células leucêmicas de contrapartida mais diferenciadas que não possuem potencial de iniciação da doença, embora carreguem mutações genéticas específicas de leucemia semelhantes. NKG2DL são bioquimicamente altamente diversos mhc classe I-like auto-moléculas. Células saudáveis em condições homeostáticas geralmente não expressam NKG2DL na superfície celular. Em vez disso, a expressão desses ligantes é induzida após a exposição ao estresse celular (por exemplo, transformação oncogênica ou estímulos infecciosos) para desencadear a eliminação de células danificadas através de lise através de células imunes expressas por receptores NKG2D, como células assassinas naturais (NK). Curiosamente, a expressão da superfície NKG2DL é seletivamente suprimida em subpopulações LSC, permitindo que essas células evitem a vigilância imunológica mediada por NKG2D. Aqui, apresentamos uma análise lado a lado de dois métodos diferentes de citometria de fluxo que permitem a investigação da expressão da superfície NKG2DL em células cancerosas, ou seja, um método que envolve reconhecimento pan-ligante e um método envolvendo coloração com múltiplos anticorpos contra ligantes únicos. Estes métodos podem ser usados para separar subpopulações celulares negativas nkg2DL viáveis com propriedades de células-tronco de câncer putativos de NKG2DL positivo não-LSC.
Introduction
As células NK são efeitos importantes do sistema imunológico inato que podem reconhecer e eliminar células malignas ou células saudáveis estressadas (por exemplo, por uma infecção viral) sem estimulação prévia de antígeno1. Esse processo é fortemente regulado através de um complexo repertório de receptores ativadores — como receptores de citotoxicidade natural (NCRs), NKG2D e CD16 — e receptores inibitórios que são em grande parte representados por receptores semelhantes à imunoglobulina assassina (KIRs)2. A ligação de KIRs com moléculas de antígeno leucócito humano (HLA) em células somáticas garante o auto-reconhecimento e transmite tolerância celular NK. Por outro lado, a ausência de auto-reconhecimento e o aumento da vinculação de receptores ativados aos seus ligantes nas células-alvo desencadeiam a liberação de grânulos citotóxicos que levam à citotoxicidade mediada por células NK1. Finalmente, as células NK podem exercer citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) vinculando-se ao receptor de ativação CD16 a alvos que expressam a porção fc de Ig (RF)2. Além da citotoxicidade direta, as células NK também podem desencadear a liberação de citocinas conectando o inato com o sistema imunológico adaptativo3.
NKG2D é um receptor de ativação importante expresso em NK, NKT, γδ T, e células T CD8+4 que permitem que tais células imunes citotóxicas reconheçam e lise NKG2D ligand (NKG2DL) expressem células-alvo. Células saudáveis geralmente não expressam NKG2DL. Em vez disso, a expressão NKG2DL é regulada em células malignas ou infectadas por vírus para torná-las favoráveis à liberação imunológica5.
A família humana NKG2DL compreende oito moléculas conhecidas entre as quais as duas moléculas relacionadas à cadeia MHC I A e B (MICA e MICB6) e as proteínas de ligação citomegalovírus UL16 1-6 (ULBP1-67). A expressão de NKG2DL é regulada nos níveis transcricional, pós-transcricional, bem como nos níveis pós-translacional8. Como tal, enquanto a expressão NKG2DL é comumente não detectável na superfície de células saudáveis, nKG2DL mRNA9 e expressão de proteína intracelular foram relatados em tecidos saudáveis. A relevância funcional de tal expressão e os mecanismos subjacentes a tais padrões de expressão discretos permanecem a ser definidos10.
A regulação mecanicista da expressão NKG2DL nas células cancerosas é uma área fascinante de investigação. Vias conhecidas por estarem envolvidas tanto no estresse celular, por exemplo, na via de estresse de choque térmico9, ou em vias associadas a danos no DNA, como a ataxia telangiectasia mutada (ATM) e a via Rad3 relacionada (ATR)11,bem como infecções virais ou bacterianas foram diretamente ligadas à indução da expressão NKG2DL12. No entanto, mesmo que a expressão superficial do NKG2DL tenha sido efetivamente induzida, essa expressão pode ser perdida novamente através do derramamento mediado proteolítico, um mecanismo associado à fuga imunológica e ao prognóstico clínico ruim em alguns cânceres13.
A ausência de nKG2DL de superfície celular também pode desempenhar papéis importantes em pacientes com LMA. Aqui, o tratamento com quimioterapia intensiva muitas vezes induz a remissão, mas a recaída ocorre frequentemente a partir de células-tronco leucmicas (LSC), que sobrevivem seletivamente às quimioterapias e evitam a resposta imune. Como mostramos recentemente, os LSCs, por exemplo, escapam da lise celular NK suprimindo a expressão de superfície NKG2DL14.
Inversamente, a ausência de expressão NKG2DL superficial pode ser usada como um método para identificar e isolar viávelmente subpopulações putativas semelhantes a troncos de células de subpopulações leucêmicas de contrapartida em massa. Aqui, apresentamos duas abordagens citométricas de fluxo que podem ser usadas para detectar a expressão da superfície NKG2DL e, assim, identificar células-tronco nkg2DL negativas na leucemia e talvez também em outros cânceres: Um método para reconhecimento da superfície pan-ligante e um método envolvendo coloração com anticorpos uni ou agrupados reconhecendo proteínas NKG2DL conhecidas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui apresentamos dois métodos citométricos de fluxo que podem detectar a expressão da superfície NKG2DL em células LMA primárias humanas. Mostramos que ambos os métodos de detecção podem ser usados em conjunto com outras manchas de anticorpos (por exemplo, detectando a expressão CD34). Manchas semelhantes também podem ser realizadas em outros tipos de células primárias e linhas celulares.
Recentemente, mostramos que a ausência de NKG2DL na superfície das explosões de pacientes…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado por bolsas da Fundação Nacional de Ciência da Suíça (179239), da Fundação para o Combate ao Câncer (Zuerich), da Fundação Wilhelm Sander à CL (2019.042.1) e da Fundação Novartis para pesquisa médico-biológica para C.L. Além disso, este projeto recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia no âmbito do acordo de subvenção Marie Skłodowska-Curie 765104. Agradecemos o apoio da Instalação de Citometria de Fluxo em Basileia.
Materials
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
| 96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
| APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
| Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
| Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
| RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) – 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
Riferimenti
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Campbell, K. S., Hasegawa, J. Natural killer cell biology: an update and future directions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Wensveen, F. M., Jelenčić, V., Polić, B. NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness. Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).
- Zingoni, A., et al. NKG2D and its ligands: “One for All, All for One”. Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).
- Eagle, R. A., Trowsdale, J. Promiscuity and the single receptor: NKG2D. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).
- El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer. Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).
- Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D. Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).
- Long, E. O. Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm. Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).
- Hüe, S., et al. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease. Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).
- Gasser, S., Raulet, D. H. Activation and self-tolerance of natural killer cells. Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).
- Groh, V., et al. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).
- Maurer, S., et al. Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells. Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).
- Paczulla, A. M., et al. Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion. Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).
- Paczulla, A. M., et al. Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice. Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Taussig, D. C., et al. Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction. Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).
- Zhou, J., Chng, W. J. Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia. World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).
