Denne protokol giver en metode til at studere Mycobacterium tuberkulose infektion i humane M1- eller M2-polariserede makrofager baseret på differentiering af perifere blod-monocytter til makrofaglignende celler, der er inficeret med GFP-mærket virulent stamme H37Rv, og analyseret med flow cytometry ved hjælp af en 10-farve panel, herunder udtryk for udvalgte M1/M2 markører.
Humane makrofager er primære værtsceller for intracellulær Mycobacteriumtuberkulose (Mtb) infektion og har dermed en central rolle i immunforsvaret af tuberkulose (TB). Vi har etableret en eksperimentel protokol til at følge immun polarisering af myeloid-afledte celler i M1 (klassisk aktiveret) eller M2 (alternativt aktiveret) makrofag-lignende celler gennem vurdering med en 10-farve flow cytometry panel, der tillader visualisering og dyb karakterisering af grøn-fluorescerende-protein (GFP)-mærket Mtb i forskellige makrofager delmængder. Monocytter opnået fra raske bloddonorer blev polariseret i M1- eller M2-celler ved hjælp af differentiering med granulocyt makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) eller makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) efterfulgt af polarisering med henholdsvis IFN-γ og lipopolysaccharide (LPS) eller IL-4. Fuldt polariserede M1- og M2-celler blev inficeret med Mtb-GFP i 4 timer, før løsrevne Mtb-inficerede makrofager blev plettet med flowcytometri ved 4- eller 24-timers postinfektion. Prøveanskaffelse blev udført med flowcytometry, og dataene blev analyseret ved hjælp af en flowcytometrianalysesoftware. Manuel gating samt dimensionalitet reduktion med Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) og fænograf analyse blev udført. Denne protokol resulterede i effektiv M1/M2 polarisering karakteriseret ved forhøjede niveauer af CD64, CD86, TLR2, HLA-DR og CCR7 på uinficerede M1-celler, mens uinficerede M2-celler udviste en stærk opregulering af M2-fænotypemarkørerne CD163, CD200R, CD206 og CD80. M1-polariserede celler indeholdt typisk færre bakterier sammenlignet med M2-polariserede celler. Flere M1/M2 markører blev nedreguleret efter Mtb infektion, hvilket tyder på, at Mtb kan modulere makrofag polarisering. Derudover viste det sig, at 24 forskellige celleklynger af forskellig størrelse var entydigt fordelt mellem M1- og M2-uinficerede og Mtb-inficerede celler ved 24-timers post-infektion. Denne M1/M2-flowcytometriprotokol kan bruges som rygrad i Mtb-makrofagforskning og vedtages til særlige behov inden for forskellige forskningsområder.
Makrofager er immunceller, der bidrager væsentligt til reguleringen af vævshomøostase, betændelse og sygdomspatologier. Som en væsentlig bestanddel af medfødt immunitet udtrykker cellernes monocyt-makrofagalage heterogene fænotyper som reaktion på ændrede miljømæssige signaler, som afspejler deres plasticitet og tilpasning til forskellige anatomiske og immunologiske placeringer1. Afhængigt af vækstfaktorerne, cytokiner og andre mæglere, der er til stede i mikromiljøet, er makrofager blevet kategoriseret i to store reversible populationer, hver med en anden rolle i bakteriekontrol og clearance2: de proinflammatoriske, klassisk aktiverede M1-polariserede makrofager og antiinflammatoriske, alternativt aktiverede M2-polariserede makrofager, der oprindeligt blev navngivet til at efterligne T-hjælper (Th) cellenomenklatur3. Denne gruppering af immunpolariserede makrofager betragtes ofte som forenklet, da makrofagaktivering og differentiering ikke er lineær, men mere præcist illustreret som et kontinuum, hvor hver befolkning har forskellige egenskaber og funktionelle roller i resultatet af sygdomsudvikling og progression4,5,6,7. Ikke desto mindre er der mange eksperimentelle fordele med M1/M2 makrofagmodellen, der kan bruges inden for flere forskellige forskningsområder.
Mycobacteriumtuberkulose (Mtb) er årsagsmidlet til tuberkulose (TB) og er blevet anslået til at inficere en person hvert sekund og betragtes som det mest dødelige enkelt infektiøse middel i verden (Global TB-rapport 2019). Da luftvejene er hovedvejen for Mtb-infektion, er alveolar makrofager de foretrukne værtsceller, der skal inficeres med Mtb og repræsenterer både de primære barrierer og det smitsomme reservoir for Mtb i lungerne. Makrofagpolarisering som reaktion på forskellige stimuli er blevet grundigt undersøgt gennem årene7 og i det meste af det offentliggjorte arbejde, M1 polarisering af monocytkulturer in vitro fremkaldes af Granulocyte-Macrophage Colony Stimuleringsfaktor (GM-CSF) sammen med IFN-γ og LPS8,9, mens M2 polarisering induceres med Macrophage Colony Stimuleringsfaktor (M-CSF) og IL-410,11. M1-makrofagerne er potente effektorceller, der formidler antimikrobielle reaktioner mod intracellulære patogener og har en væsentlig rolle i antitumorimmunitet12. M2 makrofager har på den anden side en antiinflammatorisk funktion, høj fagocytisk kapacitet og er hovedsageligt involveret i sårheling og vævsreparation samt i parasitinfektioner12. Derfor betragtes M1-makrofager som mere effektive i intracellulær kontrol af Mtb sammenlignet med M2-makrofager13. Men, Mtb bakterier har også potentiale til at modulere makrofag polarisering at undergrave medfødte immunitet14,15,16,17.
Selv om det er almindeligt at generere makrofager fra differentiering af monocytter opnået fra perifert blod18, makrofager kan også genereres fra inducerede pluripotente stamceller (iPSCs)19 eller fra knoglemarvs-afledte makrofager fra mus20,21. Disse er mulige teknikker til at studere primære makrofagceller opnået fra monocyt / makrofag stamfadere, der vil formere sig og differentiere sig til en homogen population af modne makrofag-lignende celler. Disse protokoller giver imidlertid sjældent uddybet viden om de opnåede cellers fænotype og funktion eller tager højde for den naturlige heterogenitet, der observeres blandt makrofager opnået in vivo. Da Mtb er et strengt menneskeligt patogen, er der også en fordel ved at studere Mtb i humaniserede modelsystemer. Flow cytometry er en kraftfuld teknologi, der giver mulighed for at vurdere flere fænotypiske og funktionelle egenskaber ved enkelte celler i suspension22, noget der kan være ret udfordrende med vedhængende celler som makrofager, der også er kendt for at være autofluorescerende23,24. Ud over kemisk løsrivelse af fast klæbende makrofager kan Mtb-infektion udgøre en betydelig stressfaktor for cellerne, der tilføjer et andet niveau af kompleksitet i flowcytometriske analyser af Mtb-inficerede makrofager.
I denne eksperimentelle protokol har vi brugt en tidligere etableret human makrofaginfektionsmodel baseret på immunpolarisering af primære perifere blod-monocyt-afledte celler, der er inficeret med det virulent laboratorium Mtb stamme H37Rv, og analyseret med flowcytometri ved hjælp af et 10-farvepanel, herunder udtryk for udvalgte M1- og M2-markører25. Denne protokol giver en effektiv og reproducerbar metode til at studere reaktioner på Mtb-infektion i M1 eller M2 polariserede monocyt-afledte makrofager. Derudover giver brugen af flowcytometri på vedhængende Mtb-inficerede makrofager os mulighed for at studere en række overflademarkører forbundet med konventionelle M1- og M2-makrofager og deres langsgående reaktion på Mtb-infektion. Det er vigtigt, at denne protokol let kan vedtages til undersøgelser af infektioner med andre patogener, i antisvulstundersøgelser eller i undersøgelser af inflammatoriske tilstande, til lægemiddelscreening osv. og kan også udnyttes til vurdering af M1/M2 makrofagpolarisering i kliniske humane prøver.
Denne eksperimentelle protokol beskriver effektiv polarisering af myeloid-afledte celler i M1 eller M2 fænotyper, herunder vurdering med en 10-farve flow cytometry panel, der tillader visualisering og dyb karakterisering af GFP-mærket Mtb i forskellige makrofager delsæt. Selv om TB er en gammel menneskelig sygdom, er der i øjeblikket ingen gylden standard model til at studere Mtb-makrofag interaktioner, og multi-farve flow cytometri af makrofager kan være kompliceret i forhold til analyser af lymfocyt svar. Få tilgængelige protokoller for in vitro differentiering af menneskelige monocytter til makrofager præsentere dyb viden om den type makrofager genereret. En grundlæggende protokol for polarisering af makrofaget og cytometrisk vurdering af makrofagaktivering ved hjælp af et solidt panel af markører kan sandsynligvis lette en sådan karakterisering og give mulighed for at udforske yderligere funktioner i polariserede celler, der behandles under forskellige forhold. Dette omfatter analyser af celler, der er dyrket in vitro, samt analyser af celler in vivo i kliniske prøver, dvs. Derfor kan differentiering og/eller aktiveringsstatus for monocytter og makrofager fra patienter være relateret til sygdomsudfald. Udvidelse af CD16+CD163+ monocytter i perifert blod er blevet rapporteret hos lunge-TB-patienter30. En øget hyppighed af CD163+ celler blev også påvist i den betændte hud af atopisk dermatitis patienter31. På samme måde har CD206+ M2-lignende makrofager vist sig at hæmme spredning og differentiering af celler i mikromiljøet af adipocytvæv32 og at blive beriget med knoglemarvsprøver fra patienter med akut myeloid leukæmi (AML)29. Et forhøjet forhold mellem CD64 (M1) og CD163 (M2) celler i fuldblod hos patienter med slidgigt viste sig at være forbundet med sygdom sværhedsgrad33. En anden undersøgelse, der anvendes CD86 (M1) og CD163 (M2) til at påvise, at høj M1 udtryk i væv korreleret til dårligere resultat i en undergruppe af ondartede hjernetumorer34.
Der er flere væsentlige fordele ved denne eksperimentelle M1/M2 flow cytometry protokol. Denne model giver mulighed for at studere medfødte immunresponser på virulent Mtb-infektion og kan udvikles til at indeholde undersøgelser af adaptive immunresponser ved at tilføje autologe T-celler sammen med M1 eller M2 makrofager i blandede lymfocytreaktioner (MLR). Protokollen er også velegnet til lægemiddelscreening og testning af forskellige immunmodulerende og antimikrobielle forbindelser. Her har vi tidligere studeret virkningerne af D-vitamin og histone deacetylase inhibitor phenylbutyrat på myeloid-afledte celler efter Mtb-infektion25,35. M1/M2 flow cytometry kan også bruges til at vurdere makrofag aktivering efter konditionering med cellekultur supernatants eller patient plasma. Mens in vivo-undersøgelser af TB-co-infektion med HIV eller helminths eller TB-diabetes co-morbiditet kan være udfordrende, kan den mindre komplekse M1/M2-model lette undersøgelser af co-morbiditeter in vitro. På samme måde kan protokollen udnyttes til transmissionsundersøgelser til at undersøge cellers Mtb-infektiøsitet eller til at undersøge fagocytisk såvel som antigenpræsentationskapacitet for individuelle M1/M2-celler. M1/M2 flow cytometry er også attraktivt til brug i biomarkør- og vaccineundersøgelser, til at følge sygdomsprognoser under behandling og til at teste terapier rettet mod myeloid-afledte celler. Det er vigtigt, at der anvendes en række forskellige metoder parallelt med flowcytometry til samtidig vurdering af makrofagære polariseringsphoenotyper og funktionelle reaktioner ved hjælp af konfokal mikroskopi (Figur 3D), PCR i realtid, vestlige blot, multiplex assays og ELISA af opløselige faktorer i kulturen supernatant samt vurdering af intracellulær bakteriel infektivitet og vækst ved hjælp af GFP-udtryk (flow cytometry og konfokal mikroskopi) og koloni danner enheder (CFU). Infektion af M1- eller M2-celler med Mtb-GFP-bakterier gør det også muligt at sortere de uinficerede og Mtb-inficerede celler fra samme prøve til enkeltcelle-RNA-sekventeringsanalyse.
Den beskrevne protokol har også visse begrænsninger, herunder både tekniske og videnskabelige ulemper. Ulempen ved at bruge monocyt-afledte makrofager fra humane bloddonorer er, at donorvariationen ofte er høj, og det faktum, at cellerne ikke er polariseret i det fysiologiske miljø af humane væv. Stor variation i M1/M2 polarisering effekt eller Mtb-infektiøsitet mellem donorer kan resultere i problemer med både intra-og interexperimental variationer, lav statistisk effekt, og et behov for at omfatte mange donorer for at opnå pålidelige resultater. Derudover resulterer plastisk overholdelse af monocytter fra PBMCs i et donorafhængigt antal monocytter / godt, der i sidste ende kan give en vilkårlig MOI, der kan påvirke makrofaget polarisering og celle levedygtighed efter Mtb infektion. Kritiske trin i protokollen indebærer korrekt vask for at forhindre andre celletyper i at forurene cellekulturerne, som også kan påvirke polariseringen af makrofaget. Mens en for lav MOI kan efterligne latent TB-infektion, vil en for høj MOI dræbe cellerne og fremhæve vigtigheden af at bruge en passende MOI. Desuden kan det være vanskeligt at hente fast klæbende celler ved løsrivelse, hvilket kan resultere i en forudindtaget repræsentation af visse makrofager delsæt, der anvendes til flowcytometrianalyser. Et afgørende skridt i flow cytometry analyse indebærer korrekt brug af perler kompensation matrix og negative kontroller såsom unstained celler eller FMO (Fluorescens Minus One) kontrol for at sikre korrekt manuel gating.
En anden begrænsning indebærer polarisering af monocytter afledt af blod og ikke fra det lokale vævsmiljø. Kendetegnende for human TB er dannelsen af granulomer i Mtb-inficerede væv, og immunopatologi i TB bør derfor fortrinsvis undersøges på det lokale vævssted. Monocytter rekrutteres dog til lungerne fra perifert blod ved betændelse / infektion, hvor celler kan differentiere sig til makrofager i nærværelse af inflammatoriske cytokiner som GM-CSF12. Det er vigtigt, i det fysiologiske miljø af væv in vivo, er der sandsynligvis en stor heterogenitet af makrofag polarisering, herunder en blanding og forskellige forhold mellem forskellige M1- og M2-lignende makrofagpopulationer, der bidrager til skæbnen for TB-infektion36. Vi har tidligere udviklet en human organotypisk lungevævsmodel, der muliggør 3D-undersøgelser af makrofagimedieret granulomdannelse i TB37. Det kunne være interessant at udnytte den nuværende M1/M2 polariseringsprotokol i kombination med lungevævsmodellen til yderligere at studere TB granulomadannelse, effektorfunktioner og M1/M2-forhold i eksperimentelt væv.
Denne M1/M2 flowcytometry protokol kunne let tilpasses til at omfatte et udvidet panel af myeloid markører nyttige til vurdering af funktioner forbundet med hæmmende såvel som inflammatoriske reaktioner. Der er en stor forskningsinteresse i hæmmende immun checkpoint molekyler såsom PD-1, SIRP-α, IDO og arginaser, der kunne modulere makrofag svar38. I denne sammenhæng kan polarisering af myeloidceller også involvere andre stimuli, der fremmer immunorgulatoriske makrofager (Mreg) eller myeloid-afledte suppressorceller (MDSC), der har vist sig at være involveret i flere sygdomme, herunder TB38. Mere avancerede flow cytometry paneler af M1/M2/Mreg makrofag delmængder kan også omfatte intracellulær farvning af cytokiner / kemokiner IL-1β, TNF-α, IL-10 og MCP-1 eller andre opløselige faktorer eller effekteller molekyler såsom inducible nitrogenoxid (iNOS) og antimikrobielle peptider. Dette kunne forbedre mulighederne for at studere polyfunktionelle makrofagsresponser, svarende til hvad der er blevet udførligt beskrevet for T-celler39.
I øjeblikket kan flow cytometry farvning paneler omfatte op til 30-40 farver, som giver mulighed for at immunophenotype flere celle delsæt og molekyler samtidigt. Den grundlæggende eksperimentelle opsætning af denne M1/M2 flow cytometry-protokol kan bruges som en rygrad, der er kompatibel med de fleste gamle såvel som nye flowcytometre og kan bygges på og skræddersys efter individuelle behov, herunder udfordringerne ved arbejde med virulent Mtb i et BSL-3-miljø. I dag er dimensionalitetsreduktionsteknikker som UMAP tilgængelige i de nye versioner af flowcytometry-software, som muliggør analyse af et stort antal parametre, der genereres i enkeltcelleundersøgelser, der er afgørende for forbedret visualisering og fortolkning af højdimensionelle data40. De konstante teknologiske forbedringer i flowcytometry vil sandsynligvis fortsætte i de kommende år, herunder kombinationen af multi-parametrisk fænotyping sammen med moderne cellesorteringskapaciteter, hvor denne protokol kan vise sig nyttig i flere makrofagbaserede Mtb-infektionsanalyser.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker vores kolleger i Sveriges Sundhedsagentur, Matilda Svensson og Solomon Ghebremichael for hjælp i BSL-3 laboratoriet.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Den Svenske Hjerte- og Lungefond (HLF) (2019-0299 og 2019-0302 til SB), det svenske forskningsråd (VR) (2014-02592, 2019-01744 og 2019-04720 til SB), Stiftelsen for Forebyggelse af Antibiotikaresistens (Resist), Karolinska Institutet Foundations og KID til SB (delvis finansiering af ph.d.-uddannelse for Marco Loreti) fra Karolinska Institutet. ML blev støttet af Den Svenske Børnecancerfond (TJ2018-0128 og PR2019-0100).
8-well chamber slides | Lab-Tek | 154534 | |
BD Comp bead plus | BD | 560497 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
DAPI Mounting media | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
EDTA (0.5 M) | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Falcon 6-well Flat Bottom plates | Corning Life Sciences | 353046 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Glycerol (70%) | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
GM-CSF | Peprotech | 300-03 | |
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody | Invitrogen | R37121 | Secondary antibody for CD64 |
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Secondary antibody for CD163 |
HEPES | GE Healthcare Life Sciences | SH30237.01 | |
IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
IL-4 | Peprotech | 200-04 | |
L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences | SH30034.01 | |
LPS (Escherichia coli O55:B5) | Sigma-Aldrich | L6529 | |
Lymphoprep | Alere Technologies AS | 11508545 | |
M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
Middle Brook 7H10 agar plates | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Middle Brook 7H9 media | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Mouse anti-human CD64 primary antibody | Bio-Rad | MCA756G | Clone: 10.1 |
Na-pyruvate | GE Healthcare Life Sciences | SH300239.01 | |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Rabbit anti-human CD163 primary antibody | GeneTex | GTX81526 | Polyclonal |
RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | SH30096.01 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
TubeSpin bioreactor tubes | TPP Techno Plastic Products AG | 87050 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Tween-80 | Sigma-Aldrich | P4780 |