3D Culturing av organoider fra Intestinal Villi Epithelium Gjennomgår Dedifferentiation

Summary

Prosedyren beskriver isolasjon av villi fra musen intestinal epitel gjennomgår dedifferentiation for å bestemme deres organoid forming potensial.

Abstract

Clonogenicity av organoider fra tarmepitelet tilskrives tilstedeværelsen av stamceller der. Musen liten intestinal epitel er delt inn i krypter og villi: stammen og spredningscellene er begrenset til kryptene, mens villi epitelet bare inneholder differensierte celler. Derfor kan de normale tarmkryptene, men ikke villi, gi opphav til organoider i 3D-kulturer. Prosedyren beskrevet her gjelder bare for villus epitel som gjennomgår dedifferentiation som fører til stemness. Metoden som er beskrevet, bruker den betingede mutantmusen Smad β 4^KO:β-catenin^GOF). Mutasjonen får tarm villi til å dedifferentiate og generere stamceller i villi. Intestinal villi gjennomgår dedifferentiation skrapes av tarmen ved hjelp av glass lysbilder, plassert i en 70 μm sil og vasket flere ganger for å filtrere ut eventuelle løse celler eller krypter før plating i BME-R1 matrise for å bestemme deres organoid-forming potensial. To hovedkriterier ble brukt for å sikre at de resulterende organoidene ble utviklet fra det dedifferensierende villusrommet og ikke fra kryptene: 1) mikroskopisk evaluering av den isolerte villi for å sikre fravær av tethered krypter, både før og etter plating i 3D-matrisen, og 2) overvåking av tidsforløpet for organoidutvikling fra villi. Organoid initiering fra villi oppstår bare to til fem dager etter plating og vises uregelmessig formet, mens krypt-avledede organoider fra samme intestinale epitel er tydelige innen seksten timer etter plating og virker sfæriske. Begrensningen av metoden er imidlertid at antall organoider dannet, og tiden som kreves for organoid initiering fra villi varierer avhengig av graden av dedifferensiering. Derfor, avhengig av mutasjonens spesifisitet eller fornærmelsen som forårsaker dedifferensiering, må det optimale stadiet der villi kan høstes for å analyse deres organoide formingspotensial, bestemmes empirisk.

Introduction

Tarmen krypter, men ikke villi, danner organoider når de dyrkes i Matrigel eller BME-R1 matrise. Disse organoidene er selvorganiserende strukturer, ofte referert til som “mini-gut” på grunn av tilstedeværelsen av de forskjellige differensierte avstamninger, forfedre og stamceller som er tilstede i tarmepitelet in vivo. Potensialet til å danne organoider fra krypter tilskrives tilstedeværelsen av stamceller¹. Intestinal villi derimot består bare av differensierte celler, og kan derfor ikke danne organoider. Mutasjoner² eller tilstander som tillater dedifferensiering av villus epitelet kan imidlertid føre til stamceller i villi^2,3. Denne skjebneendringen som resulterer i stemness i villi epitelet kan bekreftes ved å plating dedifferentiating villus epitel i 3D matrise for å bestemme deres organoid-forming potensial som en indikator på de-novo stemness i villus epitel. Derfor er det kritiske aspektet ved denne prosedyren å sikre fravær av kryptforurensning.

Smad4^KO:β-catenin^GOF betinget mutasjon forårsaker dedifferensiering i tarmepitelet preget av uttrykket av spredning og stamcellemarkører i villi, og til slutt dannelsen av kryptlignende strukturer i villi referert til som ektopiske krypter Tilstedeværelsen av stamceller disse dedifferensierte villi ble bestemt av uttrykket av stamcellemarkører i ektopkryptene (in vivo) og mutant villiens evne til å danne organoider wh innbelagt Matrigel³. Den nedenfor nevnte prosedyren utdyper metodikken som brukes til å bekrefte stemness av dedifferentiating intestinal epitel i Smad4^KO:β-catenin^GOF mutant mus. Et sentralt trekk ved denne metoden for å isolere villi var bruken av skraping av tarmlumen, i motsetning til EDTA-chelasjonsmetoden⁴. I motsetning til i EDTA-chelasjonsmetoden beholder villi-isolasjon ved skraping mesteparten av det underliggende mesenchymet og gjør det mulig å justere skrapetrykket for å gi villi uten bundet krypter. Skrapetrykket er subjektivt for operatøren, derfor må det optimale trykket for å gi villi uten krypter bundet bestemmes empirisk av operatøren. Det kritiske aspektet ved denne prosedyren er å sikre fravær av kryptforurensning ved mikroskopisk undersøkelse av villi både før og etter plating i BME-R1-matrisen.

Intestinal villi skrapes av tarmlumen med glasssklier og plasseres i et 70 μm filter og vaskes med PBS for å kvitte seg med løse celler eller krypter, om noen, før plating i BME-R1 matrise. Metoden understreker følgende kriterier for å unngå kryptforurensning: a) begrense villi høste den proksimale halvdelen av tolvfingertarmen der villi er den lengste, b) minimere antall villi-yielding skraper, c) vaske filteret som inneholder villi gjennom en rekke PBS i en seks-brønns tallerken, og d) bekrefter fraværet av kryptforurensning ved mikroskopisk undersøkelse før og etter plating i BME-R1 matrise. Villi isolasjon ved skraping, i stedet for ved EDTA chelation, forhindrer fullstendig tap av underliggende mesenchyme som kan gi nisjesignalene^5,6,7,8, om nødvendig, for organoid initiering fra villus epitelet.

Protocol

Alle museeksperimentene som ble utført, inkludert bruk av Tamoxifen og eutanasi ved cervical dislokasjon, hadde godkjenning fra Institutional Animal Care and Use Committee ved Stevens Institute of echnology. 1. Mus MERK: Generasjonen Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 mus har tidligere blitt beskrevet3. Voksne kvinnelige mus mellom åtte til tolv uker ble brukt. …

Representative Results

Den avgjørende faktoren for prosedyrens suksess forhindrer kryptforurensning. Organoid utvikling fra villi (og ikke fra noen forurensende krypter) sikres ved å bekrefte fire store kriterier: 1) sikre renheten av høstet villi ved mikroskopisk undersøkelse før og etter plating villi i BME-R1, 2) plating begrenset antall villi per brønn for å tillate visualisering av alle belagte villi individuelt, 3) på for å sikre utvikling av organoid daglig; bilder av tidsforløpet viser utvikling av organoider fra villi (<stro…

Discussion

Denne metoden kan bekrefte selvfornyelseskapasiteten til dedifferensierende villi epitel som får stamcellemarkører in vivo. Det normale intestinale epitelet kan gi opphav til organoider fra krypten, men ikke villi-rommet, når det dyrkes i 3D på grunn av tilstedeværelsen av stamceller i kryptene¹. Dermed bekrefter organoiddannelse fra dedifferensiert villi epitel dyrket i 3D-kulturer stamcelledannelse fra celle skjebne reversering. Rapporter om celle skjebne reversering i tarm epitele…

Materials

Advanced DMEM F-12 media	Gibco	12634010
3,3-diaminobenzidine	Vector Labs	SK-4105
96 well U-bottom plate	Fisher Scientific	FB012932
ABC kit	Vector Labs	PK4001
Angled scissor	Fisher Scientific	11-999
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9703100
CD44 antibody	BioLegend	1030001
Cdx2 antibody	Cell Signaling	12306
Corn oil	Sigma-Aldrich	C8267-500ML
Corning 70-micron cell strainer	Life Sciences	431751
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1	R&D	3433-005-R1
Dissection scissors	Fisher Scientific	22-079-747
Forceps	Fisher Scientific	17-456-209
Glutamax (100X)	Gibco	35050-061
HEK 293-T cells expressing RSPO-1	Gift from Dr. Michael Verzi
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Histogel	Thermoscientific	HG-4000-012
Mesh filter	Fisher Scientific	07-201-431
Micrscope glass slide	VWR	89218-844
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165
p200 Blunt tips	VWR	46620-642
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Primocin (50mg/mL)	Invivogen	ant-pm-1
Quality Biological Inc PBS (10X)	Fisher Scientific	50-146-770
Recombinant Murine Noggin	Peprotech	250-38
Signal diluent	Cell Signaling	8112L
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648-1G
6-well tissue culture plate	Fisher Scientific	50-146-770