تنقية توبولين مع التعديلات ما بعد النقل الخاضعة للرقابة وIsotypes من مصادر محدودة من قبل دورات البلمرة- Depolymerization

Summary

يصف هذا البروتوكول تنقية التوبولين من مصادر صغيرة / متوسطة الحجم مثل الخلايا المستزرعة أو أدمغة الماوس الواحدة ، وذلك باستخدام دورات البلمرة وإزالة البوليمر. يتم إثراء التوبولين المنقى في أنواع متساوية محددة أو لديه تعديلات محددة بعد النقل ويمكن استخدامه في فحوصات إعادة تشكيل المختبر لدراسة ديناميكيات microtubule والتفاعلات.

Abstract

أحد الجوانب الهامة لدراسات الهيكل الخلوي microtubule هو التحقيق في سلوك microtubule في تجارب إعادة تشكيل المختبر. أنها تسمح بتحليل الخصائص الجوهرية لل microtubules، مثل الديناميات، وتفاعلاتها مع البروتينات المرتبطة microtubule (MAPs). “رمز توبولين” هو مفهوم الناشئة التي تشير إلى isotypes توبولين مختلفة ومختلف التعديلات ما بعد النقل (PTMs) والمنظمين للخصائص microtubule والوظائف. لاستكشاف الآليات الجزيئية للشفرة التوبولين, من المهم إجراء تجارب إعادة تشكيل في المختبر باستخدام tubulin تنقية مع isotypes محددة وPTMs.

حتى الآن، كان هذا تحديا من الناحية الفنية كما توبولين الدماغ، والذي يستخدم على نطاق واسع في التجارب المختبرية، ويؤوي العديد من PTMs ولها تكوين isotype محددة. ومن ثم، وضعنا هذا البروتوكول لتنقية التوبولين من مصادر مختلفة ومع التراكيب isotype مختلفة وPTMs التي تسيطر عليها، وذلك باستخدام النهج الكلاسيكي من البلمرة ودورات إزالة البوليمر. بالمقارنة مع الأساليب القائمة القائمة على تنقية تقارب، وهذا النهج ينتج نقية، البلمرة المختصة التوبولين، كما يتم التخلص من أنبوبولين مقاومة للبوليمرة أو إزالة البوليمر خلال خطوات تنقية المتعاقبة.

نحن نصف تنقية التوبولين من خطوط الخلية ، التي تزرع إما في التعليق أو كثقافات معتنقة ، ومن أدمغة فأرة واحدة. تصف الطريقة أولا توليد كتلة الخلية في كل من إعدادات التعليق والتمسك ، وهي خطوة التحلل ، تليها المراحل المتعاقبة لتنقية التوبولين عن طريق دورات البلمرة والتخلص من البوليمر. تنتج طريقتنا التوبولين الذي يمكن استخدامه في التجارب التي تعالج تأثير رمز التوبولين على الخصائص الجوهرية للميكروبات وتفاعلات microtubule مع البروتينات المرتبطة بها.

Introduction

تلعب الخلايا الدقيقة أدوارا حاسمة في العديد من العمليات الخلوية. أنها تعطي الخلايا شكلها، وبناء المغزل ميوتيك وميتوتيك للفصل الكروموسوم، وبمثابة مسارات للنقل داخل الخلايا. لأداء هذه الوظائف المتنوعة، تنظم البيبات الدقيقة نفسها بطرق مختلفة. أحد الأسئلة المثيرة للاهتمام في هذا المجال هو فهم الآليات الجزيئية التي تسمح للخلايا الدقيقة المحفوظة هيكليا وتطوريا بالتكيف مع هذا العدد الكبير من المنظمات والوظائف. آلية واحدة محتملة هي تنويع microtubules ، والتي يتم تعريفها من خلال المفهوم المعروف باسم “رمز توبولين”^1،2،3. يتضمن رمز توبولين عنصرين رئيسيين: الدمج التفاضلي للمنتجات الجينية α β-توبولين (أنواع توبولين) في الأنابيب الدقيقة وتعديلات ما بعد النقل الأنبوبي (PTMs).

منذ السبعينيات، مهدت تجارب إعادة تشكيل المختبر، إلى جانب تقنيات المجهر الخفيف المتطورة، الطريق لاكتشافات مهمة حول خصائص الميكروبات: عدم الاستقرار الديناميكي⁴ والمطحنة^5،وآلياتها ووظائفها الأخرى^{6و7و8و9و10و11و12و13و14و15.} تقريبا جميع التجارب في المختبر التي أجريت حتى الآن وقد استندت على tubulin تنقيتها من أنسجة المخ باستخدام دورات متكررة من البلمرة وإزالة البوليمر^16،17. على الرغم من أن تنقية من أنسجة الدماغ يمنح ميزة الحصول على توبولين عالية الجودة بكميات كبيرة (عادة كميات غرام), عيب واحد مهم هو التغايرية كما tubulin تنقيتها من أنسجة الدماغ هو مزيج من isotypes توبولين مختلفة ويتم إثراء مع العديد من PTMs توبولين. هذا التغايرية يجعل من المستحيل تحديد دور PTM توبولين معينة أو isotype في السيطرة على خصائص microtubule والوظائف. وبالتالي، إنتاج التوبيولين التجميع المختصة مع PTMs توبولين الخاضعة للرقابة وتكوين isotype متجانسة أمر ضروري لمعالجة الآليات الجزيئية للرمز توبولين.

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نهج لتنقية التوبولين عن طريق الكروماتوغرافيا تقارب باستخدام TOG microtubule ملزمة (الجينات المفرطة في التعبير عن الورم) مجال الخميرة Stu2p¹⁸. في هذه الطريقة ، يتم تمرير التوبولين في اللخص الخام من الخلايا أو الأنسجة من خلال عمود حيث يرتبط بمجال TOG المشلولين بالمصفوفة ، والذي يسمح بتحليل بركة التوبولين بأكملها لعينة معينة ، حتى صغيرة جدا. كما تم وصف نهج طال انتظاره لتنقية التوبولين المؤتلف في السنوات الأخيرة. وهو يقوم على نظام فيروس الباكولو ، حيث يتم التعبير عن ناقل ثنائي ال سيسترونيك يحتوي على جينات α β توبولين في خلايا الحشرات¹⁹. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة مرهقة جدا وتستغرق وقتا طويلا، وبالتالي تستخدم في الغالب لدراسة تأثير الطفرات التوبولين²⁰ وأنابيب isotypes^21،22،23 في المختبر.

في البروتوكول الحالي، ونحن نصف الطريقة التي تستخدم راسخة وتستخدم على نطاق واسع نهج البلمرة-depolymerization كمخطط لتوليد توبولين مع مستويات مختلفة من التعديل إما من خطوط الخلية أو من أنسجة الدماغ الماوس²⁴. في هذا الإجراء، يتم تدوير التوبولين بين القابل للذوبان (أنبوبي ديمر في 4 درجة مئوية) وشكل بلمرة (microtubule في 30 درجة مئوية في وجود جوانوسين 5′-ثلاثي الفوسفات [GTP]). يتم فصل كل نموذج من خلال خطوات متتالية من الطرد المركزي: ستبقى أجهزة الدرنات في النتواة الفائقة بعد دوران بارد (4 درجة مئوية) ، في حين سيتم إعادة الكريات الدقيقة عند 30 درجة مئوية. وعلاوة على ذلك، يتم تنفيذ خطوة واحدة البلمرة في ارتفاع piperazine- N،N′-bis(2-ethanesulfonic حمض) (PIPES) التركيز، والذي يسمح لإزالة البروتينات المرتبطة microtubule من microtubules وبالتالي، من tubulin تنقية أخيرا. Tubulin تنقيتها من خلايا هيلا S3 نمت كما تعليق أو الثقافات المنضمة خالية تقريبا من أي PTM tubulin وقد استخدمت في التجارب الأخيرة في المختبر إعادة تشكيل^25,26,27,28. لقد قمنا كذلك بتكييف الطريقة لتنقية التوبولين من أدمغة فأرة واحدة ، والتي يمكن استخدامها لعدد كبير من نماذج الماوس مع تغييرات في أنواع التوبولين وPTMs.

في البروتوكول، ونحن أول وصف جيل من المواد المصدر (كتلة الخلية أو أنسجة الدماغ)، تحلل لها (الشكل 1A)،تليها الخطوات المتتالية من البلمرة توبولين وإزالة البوليمر لتنقية التوبولين (الشكل 1B). ونحن كذلك وصف عملية لتقييمنقاء (الشكل 2A، B)وكمية (الشكل 3A، B) من tubulin المنقى. ويمكن تكييف هذه الطريقة لإنتاج التوبولين المخصب مع PTM مختارة عن طريق الإفراط في التعبير عن انزيم تعديل في الخلايا قبل تنقية التوبولين (الشكل 4B). بدلا من ذلك، يمكن إضافة الإنزيمات المعدلة للتوبولين إلى التوبولين أثناء عملية التطهير. وأخيرا، يمكننا تنقية tubulin تفتقر إلى isotypes محددة أو PTMs من أدمغة الفئران ناقصة في الإنزيمات تعديل tubulin المقابلة (الشكل 4B)²⁹.

الطريقة التي نصفها هنا لها ميزتان رئيسيتان: (1) أنها تسمح بإنتاج كميات كبيرة بما فيه الكفاية من التوبولين في وقت قصير نسبيا ، و (2) تولد توبولين نقي عالي الجودة ، مع تكوين أي نوع توبولين محدد أو PTMs. في الفيديو المصاحب لهذه المخطوطة، نسلط الضوء على بعض الخطوات الحاسمة التي ينطوي عليها هذا الإجراء.

Protocol

وقد أجريت رعاية الحيوانات واستخدامها لهذه الدراسة وفقا لتوصيات الجماعة الأوروبية (2010/63/UE). وقد وافقت لجنة الأخلاقيات التابعة لمعهد كوري CEEA-IC #118 (التفويض رقم 04395.03 الصادر عن السلطة الوطنية) على الإجراءات التجريبية امتثالا للمبادئ التوجيهية الدولية. 1. إعداد الكواشف لتنقية توبو…

Representative Results

الهدف الرئيسي من هذه الطريقة هو إنتاج عالية الجودة، والتوبيولين الجمعية المختصة بكميات كافية لإجراء التجارب المتكررة في المختبر مع المكونات المنقى. ويمكن استخدام Microtubules تجميعها من هذا tubulin في إعادة تشكيل المقايسات على أساس الانعكاس الداخلي الكلي fluorescence (TIRF) تقنية المجهر مع microtubules إما دي?…

Discussion

الطريقة الموصوفة هنا يوفر منصة لتوليد بسرعة عالية الجودة، والتوبيولين التجميع المختصة بكميات متوسطة كبيرة من خطوط الخلية وأدمغة الماوس واحد. وهو يقوم على بروتوكول الذهب القياسية لتنقية التوبولين من العقول البقرية المستخدمة في هذا المجال لسنوات عديدة^16،17….

Materials

1 M MgCl2	Sigma	#M1028
1-L cell culture vessels	Techne F7610		Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol	Sigma	#M3148	2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride	Sigma	#A8456
40% Acrylamide	Bio-Rad	#161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS)	Sigma	#A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10	Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa		dilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335	AdipoGen	#AG-20B-0020	dilution: 1/20,000
Aprotinin	Sigma	#A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles			For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge			For collecting spinner cultures
Biological stirrer	Techne MCS-104L		Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide	Bio-Rad	#161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax®			For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	#A7906
Bromophenol blue	Sigma	#1.08122
Carboxypeptidase A (CPA)	Sigma	#C9268	Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	#D8418	DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium	Life Technologies	#41965062
DTT, DL-Dithiothreitol	Sigma	#D9779
EDTA	Euromedex	#EU0007-C
EGTA	Sigma	#E3889
Ethanol absolute	Fisher Chemical	#E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	#F7524
French pressure cell press	Thermo electron corporation	#FA-078A	with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol	VWR Chemicals	#24388.295
Glycine	Sigma	#G8898
GTP	Sigma	#G8877
Heating block	Stuart	#SBH130D
Hela cells		ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells	ATCC	ATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl )	VWR	#20252.290
Inverted microscope			With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol	VWR	#20842.298
jetPEI	Polyplus	#101
JLA-8.1000 rotor			For collecting spinner cultures
KOH	Sigma	#P1767	KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine	Life Technologies	#25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes	Sigma	4-16 K
Leupeptin	Sigma	#L2884
Liquid nitrogen
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
Micropestles	Eppendorf	#0030 120.973
Mouse brain tissue			Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm	Terumo	#18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm	Terumo	#20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm	B.Braun	#466 5643
Parafilm
PBS	Life Technologies	#14190169
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	#15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	#P7626	PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES	Sigma	#P6757
Pipette-boy
Rotors	Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment	Bio-Rad	#1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate	VWR	#442444H	For preparing Laemmeli buffer
SDS, Sodium dodecyl sulphate	Sigma	#L5750	For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator	Branson	#101-148-070	Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes	Eppendorf	5417R
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma	#9281
Trichostatin A (TSA)	Sigma	#T8552
Triton X-100	Sigma	#T9284
Trizma base (Tris)	Sigma	#T1503
Trypsin	Life Technologies	#15090046
Ultracentrifuge rotors		TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors	Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#357448	for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#349622	for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#355631	for using with 70.1 Ti rotor
Ultracentrifuges	Beckman	Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent)	Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holders			Set at 30°C