自动步态分析是评估周围神经损伤和脊髓挫伤啮齿动物模型功能恢复的可行工具。虽然它只需要一个设置来评估各种实验模型中的运动功能,但细致的软件调整和动物训练是非常重要的。
外周和中枢神经损伤主要研究在啮齿动物,特别是大鼠身上,因为这些动物模型既具有成本效益,而且文献中已经发表了大量比较数据。这包括多种评估方法,用于研究神经损伤和修复后的功能恢复。除了通过组织学、电生理学和其他体内和体外评估技术评估神经再生外,功能恢复是确定神经再生程度最重要的标准。自动步态分析允许记录大量与步态相关的参数,如爪打印区域和爪子摆动速度,以及肢体间协调的测量。此外,该方法还提供神经损伤后和神经再生期间大鼠爪子的数字数据,进一步了解外周和中枢神经损伤如何影响它们的运动行为。除了主要使用的坐骨神经损伤模型外,还可以通过这种方法研究外周神经损伤模型,如股骨神经。除了周围神经系统的伤害外,还可以评估中枢神经系统的病变,例如脊髓挫伤。有效和可重复的数据评估在很大程度上取决于在数据采集之前对硬和软件设置进行细致的调整。此外,对实验动物进行适当的训练也至关重要。这项工作旨在说明使用计算机自动化步态分析来评估周围神经损伤和脊髓挫伤的不同动物模型的功能恢复。它还强调了该方法的局限性,例如,由于功能恢复受限,对坐骨神经瘤大鼠的神经再生进行评估。因此,该协议被认为有助于对周围和中枢神经损伤感兴趣的研究人员评估啮齿动物模型中的功能恢复。
周围和中枢神经系统的损伤经常在啮齿动物中研究,导致大量有关神经损伤、修复或神经保护过程的比较数据,以抵消进一步的继发损伤和再生1、2、3。啮齿动物模型中实验治疗策略的结果可以通过组织学、免疫组织化学、电生理学和成像技术(如X射线显微断层扫描)等多种技术进行评估,但确定治疗成功与否最重要的标准是——就像人类患者一样——功能恢复的程度4,5。调查啮齿动物运动性能的第一项研究可追溯到20世纪40年代6、7、8。老鼠和老鼠要接受大量的研究,调查它们在9、10、11的几十年中运动的行为。目前,对周围神经和中枢神经损伤的啮齿动物模型存在广泛的评估技术,从用墨水和纸张12、13、14对脚踝和步态运动学15、16、17到机器学习增强方法的行走轨迹分析,允许对步态、肢体和关节轨迹18、19的复杂估计。
计算机化自动步态分析 (AGA) 用于评估周围和中枢神经损伤以及此类损伤的潜在实验治疗后运动功能。该装置主要由玻璃走道和光源组成,该光源可照亮啮齿动物的爪印,与啮齿动物所施加的压力相关。然后,将这些数据计算机化,以计算大量静态和动态参数。根据Deumens的说法,这些参数可以进一步细分为一般参数、疼痛相关参数以及步态20的协调相关参数(表1)。AGA检测步态行为变化的可行性已在各种动物模型的周围神经损伤(PNI)21中得到证实,如坐骨神经20,股骨神经22,中位神经23,24。它也经常用于评估中枢神经损伤大鼠的机运动功能,例如中风25或脊髓挫伤26。该方法的进步在于大量的可比数据,以及记录与步态27相关的大量参数的可能性。本文旨在为对PNI和脊髓损伤(SCI)动物模型感兴趣的研究人员提供详细的实践指南,以评估这些模型中的运动功能。
类别 | 参数 | 描述 | |
步态的一般参数 | 打印面积(距离单位) | 爪印区域 | |
打印长度(距离单位) | 爪印的长度 | ||
支撑基(BoS)(距离单位) | 两个后爪或前爪之间的距离 | ||
步长(距离单位) | 爪子连续放置两个位置之间的距离 | ||
与步态疼痛相关的参数 | 摆动时间 | 摆动阶段的持续时间 | |
站立时间 | 姿态阶段的持续时间 | ||
平均爪打印强度(任意单位) | 平均在姿势阶段爪印的 iintity | ||
与协调有关的步态参数 | 法线步序模式 (NSSP) | 在步进周期中,爪子放置的特定序列 | |
相位分散(%) | 两个特定爪子的步进周期之间的时间差异 | ||
规律指数 (RI) (%) | 通过将完美无瑕的 NSSP 倍数 4 除以一步周期内爪子放置的总数来量化间位协调 |
表1:可通过自动步态分析评估的步态参数。 参数分类的类别根据Deumens等人20进行选择。
由于评估方法种类繁多,各有优缺点,因此对PNI和SCI动物模型的功能恢复的评估仍然具有挑战性。在外周和中枢神经损伤的多种模型中,只有很少的方法得到测试和验证,尽管将运动跟踪和机器学习相结合的有前途的新技术可能会将神经行为研究推向更高水平的功能测试。我们相信,广泛适用于各种动物和伤害模型的尖端方法将很快出现。鉴于这些考虑,AGA的优点之一是只需使用一种设备就评估多个神经损伤模型的功能恢复。自21世纪早期开始,这种方法一直用于PNI的实验模型,如坐骨神经37、佩罗内38、股骨神经损伤模型22以及腰椎39和胸椎40的根部外伤。各种中枢神经损伤,包括脊髓挫伤,也已研究的方法41,42。本文提出了如何诱发三种常用神经损伤以及评估其后功能恢复的详细方案。我们认为,为对实验神经损伤、修复和再生领域感兴趣的研究人员提供实践指南,指导如何最有效地利用该方法的优势特性,将大有作为。
几位作者讨论了AGA评估啮齿动物功能恢复的潜力,强调了该方法同时评估与运动和感觉再分析相关的步态参数的优势27,28。此外,比较实验爪子的数据,例如,重建神经损伤的未操作的爪子,如所示的两个模型显示允许包括动物内部的阳性控制。相反,没有手术重建或额外治疗的手术爪可以作为动物内部的阴性控制。研究还表明,有可能将 AGA 与机器学习方法43 相结合。尽管该方法的优点,它也有一些限制和缺点,如耗时的训练努力,这是强制性的,使动物适应收购程序28,44。AGA 的另一个限制是,由于仪器尺寸有限,有资格进行测试的动物的最大尺寸。因此,AGA的使用目前仅限于动物大小的啮齿动物和雪铁龙45。此外,最近出现的神经行为评估方法在运动跟踪领域能够机器学习可能超过GA在全面性以及可能的应用18,19,46。最值得注意的是,但根据其他评估方法,AGA评估的功能恢复似乎非常有限——即使发生的话——在坐骨神经神经瘤模型47,48。另一方面,AGA 允许全面评估股骨神经紧张后的功能恢复过程,如我们的数据所示。通过这项工作,我们证明了 Paw Print 区域是一个通过 AGA 评估的代表性步态参数,在我们提供的两种上述外周神经损伤模型中,它是功能恢复过程的典范。虽然功能恢复广告在股骨神经自动重力修复后可观察到,但AGA参数在坐骨神经自动重力修复后,在观察期结束时仍与基线相比有显著变化。值得注意的是,肢体收缩是坐骨神经损伤大鼠的常见现象,有必要谨慎,不要混淆这些肌肉不平衡和瘫痪的迹象与进行中的功能恢复32。这一方面突出了 AGA 方法在此模型中神经损伤后无法检测到显著功能恢复。另一方面,通过步态分析,评价大鼠坐骨神经损伤模型是否可行提出了问题,即神经损伤比阿未克症48更严重的神经损伤。大鼠仍然是最常用的实验神经修复模型。疑难解答详细信息在补充文件 1 中提供。
我们还提供了关于使用该方法来评估脊髓损伤大鼠运动功能的示范性数据,无需对硬件设置或采集程序进行任何必要的更改即可。同样的原则也适用于其他啮齿动物模型的中枢神经损伤(CNI)26,49,50和根外伤。与孤立的PNIS相比,脊髓损伤的病理生理后果要复杂得多,因为许多非常重要的结构被损坏,涉及发泡通路,如皮质球菌和红宝石,以及诸如背柱和脊柱35等的发泡途径。充分评估这些病理变化的挑战反映在行为测试的综合军备中,如巴索、贝蒂和布雷斯纳汉(BBB)得分36。据报道,在中枢神经损伤后,步态参数基础增加,这很可能导致了步态不稳定。在我们的模型中,支持基础从WPO10到WPO14的基线发生了显著变化,这支持支持基础的假设支持支持基础允许 AGA 在胸脊髓挫伤后评估功能恢复过程。
我们相信,AGA是一个可行的工具,以评估在神经系统受伤的啮齿动物的功能恢复。然而,我们建议在每个实验设置中仔细和彻底地反映观察到的步态变化。步态参数的改变,例如,在术后立即减少的十近月数后,打印面积增加,或在观察期间立即提高该参数的术后高度,则打印面积增加,并不不可避免地与功能恢复有关。相反,这些变化也可以与可能的功能适应有关,以保持一个不显眼的步态,因为老鼠是一个猎物物种,并试图避免显示疼痛或残疾的潜在掠食者51。因此,建议使用自动步态分析作为补充工具,将步态变化与周围神经损伤和再生的其他结果测量方法联系起来。如前所述,我们还认为,如果应该通过 AGA 对患有坐骨神经瘤的啮齿动物进行调查,应该仔细反映,因为我们的发现有力地表明,在这种情况下,功能恢复受到严重限制。
如我们的工作所示,AGA 的主要资产是能够研究多种实验性 PNI 模型和 CNI 中的电机和感官再分析,同时只需要一个设置。因此,我们认为,该方法是全面神经行为测试的一个极有价值的工具。AGA的资产之一,即研究运动和感官再呼吸在PNI和CNI的各种动物模型,而只需要一个设置,是我们认为该方法的主要优势相比,其他评估方法研究功能恢复,如步行轨道分析52,冯弗雷测试53,或步态运动学16。同时评估步态变化的潜力,这些变化与再紧张肌肉22 的电生理学调查结果或感觉功能54 的评价方法有关,在该方法的未来应用方面是有希望的。因此,我们建议使用 AGA 来研究前肢 PNI 的啮齿动物模型的功能恢复,如乌尔纳、径向神经或中位神经,或实验神经转移模型55,这些模型尚未对此方法进行研究。
我们特此提供了如何使用自动步态分析来研究三种神经损伤啮齿动物模型的功能恢复的详细协议。虽然该方法需要仔细考虑各种关键方面,如充分训练和细致的硬和软件校准,它是一个可行和有价值的补充工具,以评估神经再生的啮齿动物模型的中枢和外周神经损伤。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢卡琳·布伦纳对动物的热情照顾。作者还要感谢克劳迪娅·凯布尔、詹姆斯·弗格森、加布里埃尔·莱因费勒和苏珊·德瑞斯勒在实验手术中提供的援助。
0.9% Saline | B. Braun Austria | 3570410 | Vehicle for drug delivery |
1 ml syringe | B. Braun Austria | 9161708V | Injecting device |
10 ml syringe | B. Braun Austria | 4606728 V | Injecting device |
1-Propanol, 2-Propanol, Hexetidin | Gebro Pharma | N/A | Alcoholic skin disinfection |
23-gauge (G) canula | B. Braun Austria | 4657667 | Canula for s.c. injection |
26-gauge (G) canula | B. Braun Austria | 4657683 | Canula for s.c. injection |
5 ml syringe | B. Braun Austria | 4606710 V | Injecting device |
Buprenorphine hydrochloride | Sigma | B9275 | Analgetic agent |
Burrs for Micro Drill | F.S.T | 19007-29 | Drilling of a hole inside the lamina |
Caprofen | Zoetis Austria | N/A | Analgetic agent |
Catwalk Automated gait analysis system | Noldus | N/A | Automatic analysis software of animal gait |
Cauterizer Kit | F.S.T | 18010-00 | Cauterization of vessels during surgery |
Enrofloxacin | Bayer Austria | N/A | Antibiotic |
Ethilon (10-0) | ETHICON | 2810G | Suture material for neurrorhaphy |
Ethilon (11-0) | ETHICON | EH7465G | Suture material for neurrorhaphy |
Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | 4302436 | Eye protection during anesthesia |
Friedman-Pearson Rongeurs | F.S.T | 16221-14 | Surgical instrument |
Gabapentin | Wedgewood Pharmacy | N/A | Analgetic agent |
Goldstein retractor | F.S.T | 17003-03 | Retraction of tissues during surgery |
Hair trimmer | Aescular | N/A | Hair trimmer for shaving of the operation site prior to surgery |
Heating Pad for rodents | ALA Scientific Instruments | N/A | Regulation of body temperature |
Impactor | Precision Systems and Instrumentation | N/A | Induction of spinal cord contusion |
Lewis rat (![]() |
Janvier | N/A | Experimental animal |
Magnetic Fixator Retraction System | F.S.T | 18200-50 | Retraction of tissues during surgery |
Metzenbaum Baby Scissors | F.S.T | 14019-13 | Surgical instrument |
Micro Drill | Word Precision Instruments | 503599 | Instrument for bone drilling |
Micro Needle holder | F.S.T | 12076-12 | Surgical instrument |
Micro-scissors (curved) | F.S.T | 15023-10 | Surgical instrument |
Micro-scissors (straight) | F.S.T | 15007-08 | Surgical instrument |
Mirror Finish Forceps | F.S.T | 11251-23 | Surgical instrument |
Needle holder | F.S.T | 12002-12 | Surgical instrument |
Operating microscope | Leica | M651 MSD | Magnification of the operative site |
Povidone Iod | B. Braun Melsungen | N/A | Non-alcoholic skin disinfectant |
Pulse Oximeter | STARR Life Sciences | N/A | Surveillance of heart rate and oxygen saturation |
Rodent thermometer | BIOSEB | BIO-TK8851 | Surveillance of body temperature |
Scalpel blade | F.S.T | 10010-00 (#10) | Surgical instrument to make an incision |
Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 (#3) | Surgical instrument to make an incision |
Sevoflurane Inhalation Vapour, Liquid (100%) | Baxter | HDG9117A | Anesthetic |
Spatula & Probe | F.S.T | 10090-13 | Surgical instrument |
Sprague Dawley rat (![]() |
Janvier | N/A | Experimental animal |
Sterila gauze 5x5cm | EVAC MEDICAL | E010.03.00215 | Sterile gauze compress |
Tissue Forceps | F.S.T | 11021-12 | Surgical instrument |
Vicryl (4-0) | ETHICON | V3040H | Suture material for subcutaneous sutures |
Vicryl (5-0) | ETHICON | V303H | Suture material for subcutaneous sutures |
Vicryl cutting needle (4-0) | ETHICON | V392ZH | Suture material for skin sutures |
Vicryl cutting needle (5-0) | ETHICON | V391H | Suture material for skin sutures |