我们提出了一个体外模型,以评估神经损伤后嗅觉包裹胶质(OEG)神经再生能力。它基于OEG单层的轴突成人视网膜结节神经元(RGN)的共生和随后的轴再生研究,通过分析RGN轴突和声乐内皮标记。
嗅觉包裹胶质 (OEG) 细胞从嗅觉粘膜一直定位到嗅球的嗅觉神经层 (ONL)。在整个成年生活中,它们是新产生的嗅觉神经元的轴突生长的关键,从拉米纳预言家到ONL。由于其亲再生特性,这些细胞已被用于促进脊髓或视神经损伤模型的轴突再生。
我们提出了一个体外模型,以检测和测量神经损伤后OEG神经再生能力。在这个模型中,可逆不朽的人类OEG(ihOEG)被培养为单层,视网膜从成年大鼠中提取,视网膜结石神经元(RGN)被共同培养到OEG单层。96小时后,通过免疫荧光分析RGN中的轴突和索马托内皮标记,并量化带轴突的RN数量和平均轴突长度/神经元。
此协议比依赖胚胎或产后神经元的其他体外检测具有优势,它评估成人组织中的OEG神经再生特性。此外,它不仅可用于评估 ihOEG 的神经再生潜力,而且可以扩展到 OEG 或其他胶质细胞的不同来源。
成人中枢神经系统(CNS)神经元在受伤或患病后再生能力有限。促进CNS再生的一个共同策略是移植,在损伤部位,诱导轴突生长的细胞类型,如干细胞,施万细胞,星形细胞或嗅觉包裹胶质(OEG)细胞1,2,3,4,5。
OEG源自神经峰6,位于嗅觉粘膜和嗅球中。在成人中,嗅觉神经元由于环境暴露而定期死亡,并被新分化的神经元所取代。OEG包围和引导这些新的嗅觉轴突进入嗅球,并建立新的突触,他们的目标在CNS7。由于这些生理属性,OEG已被用于CNS损伤的模型,如脊髓或视神经损伤,其神经再生和神经保护特性被证实为8,9,10,11。几个因素已被确定为负责这些细胞的亲再生特征,包括细胞外基质蛋白酶生产或分泌神经营养和轴突生长因子12,13,14。
鉴于扩大原OEG细胞的技术局限性,我们以前建立并定性了可逆不朽的人类OEG(ihOEG)克隆系,它提供了无限的均匀OEG供应。这些 ihOEG 细胞源自原始培养物,这些培养物来自验尸中获得的嗅觉球茎。它们通过端粒酶催化亚单(TERT)和上基因Bmi-1的转导而永生,并与SV40病毒大T抗原15、16、17、18一起改良。其中两个ihOEG细胞系是Ts14,它保持了原始培养物和Ts12的再生能力,Ts12是一种低再生线,在这些实验中用作低再生控制。
为了评估OEG在神经损伤后促进轴突再生的能力,已经实施了几个体外模型。在这些模型中,OEG应用于不同神经元起源和中性形成和拉长的培养物——对胶质文化的反应——被检测。这些神经元来源的例子有新生儿大鼠皮质神经元19,从皮质组织对大鼠胚胎神经元进行划伤20,大鼠视网膜外泄21,大鼠下丘脑或海马产后神经元22,23 ,产后大鼠鼻脊髓根结节神经元24个,产后小鼠皮质脊髓神经元25个,人类NT2神经元26个,或产后脑皮质神经元对反应性星形细胞疤痕样培养27个。
然而,在这些模型中,再生检测依赖于胚胎或产后神经元,这些神经元具有受伤的成人神经元所缺乏的内在可塑性。为了克服这个缺点, 我们提出了一个成人轴突再生模型在OEG线的培养与成人视网膜结节神经元(RN),基于一个最初由威格利等人28,29,30,31和修改和使用我们组12,13,14,15,16,17,18,32,33。简言之,视网膜组织从成年大鼠中提取,用木瓜消化。视网膜细胞悬浮液随后被镀在多晶硅处理的盖片上或 Ts14 和 Ts12 单层上。培养物在修复前保持96小时,然后进行轴突(MAP1B和NF-H蛋白)34和体血体(MAP2A和B)35标记的免疫荧光。轴突再生被量化为轴突神经元的百分比,关于RGN的总数,轴再生指数被计算为每个神经元的平均轴突长度。此协议不仅可用于评估 ihOEG 的神经再生潜力,而且可以扩展到 OEG 或其他胶质细胞的不同来源。
OEG移植在CNS损伤部位被认为是一个有希望的治疗CNS损伤,因为它构成亲神经再生属性7,8,9。然而,根据组织来源-嗅觉粘膜(OM-OEG)与嗅球(OB-OEG)-或捐赠者的年龄,这种能力存在相当大的差异26,31,33,36。因此,在开始体内?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了SAF2017-82736-C2-1-R项目的财政支持,该项目由西恩西亚·埃因诺瓦西翁部长到MTM-F,由弗朗西斯科·德维托里亚基金会向JS提供。
antibody 514 | Reference 34 | Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B. | |
antibody SMI-31 | BioLegend | 801601 | Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins |
anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher | A-21202 | |
anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody | ThermoFisher | A-21207 | |
B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma | 283967 | NMDA receptor inhibitor |
DAPI | Sigma | D9542 | Nuclei fluorescent stain |
DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | Cell culture medium |
FBS | Gibco | 11573397 | Fetal bovine serum |
FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | Fetal bovine serum |
Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | Mounting medium |
ImageJ | National Institutes of Health (NIH-USA) | Image software | |
L-Glutamine | Lonza | BE17-605F | |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Neuronal cells culture medium |
Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | For use in neural cell isolation |
PBS | Home made | ||
PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Bacteriostatic and bactericidal |
Pituitary extract | Gibco | 13028014 | Bovine pituitary extract |
Poly -L- lysine (PLL) | Sigma | A-003-M |