Cocultura di neuroni ganglionali retini di ratto axotomizzati con glia ensheathing olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assionale adulta
Summary
Presentiamo un modello in vitro per valutare la capacità neuroregenerativa olfattiva di glia (OEG), dopo la lesione neurale. Si basa su una cocultura di neuroni ganglionali della retina adulta assotomizzati (RGN) su monostrati OEG e sul successivo studio della rigenerazione assonale, analizzando marcatori assonali e somatodendritici RGN.
Abstract
Le cellule olfattive di glia ensheathing (OEG) sono localizzate dalla mucosa olfattiva a e nello strato nervoso olfattivo (ONL) del bulbo olfattivo. Per tutta la vita adulta, sono fondamentali per la crescita assonale dei neuroni olfattivi appena generati, dalla lamina propria all’ONL. A causa delle loro proprietà pro-rigenerative, queste cellule sono state utilizzate per favorire la rigenerazione assonale nel midollo spinale o nei modelli di lesione del nervo ottico.
Presentiamo un modello in vitro per testare e misurare la capacità neuroregenerativa OEG dopo la lesione neurale. In questo modello, l’OEG umano reversibilmente immortalato (ihOEG) è coltivato come monostrato, le retine vengono estratte da ratti adulti e i neuroni ganglionari retinali (RGN) sono coculati sul monostrato OEG. Dopo 96 ore, i marcatori assonali e somatodendritici nelle RGN vengono analizzati per immunofluorescenza e il numero di RGN con assone e la lunghezza assionale media / neurone vengono quantificati.
Questo protocollo ha il vantaggio rispetto ad altri saggi in vitro che si basano su neuroni embrionali o postnatali, che valuta le proprietà neuroregenerative OEG nel tessuto adulto. Inoltre, non è solo utile per valutare il potenziale neuroregenerativo di ihOEG, ma può essere esteso a diverse fonti di OEG o altre cellule gliali.
Introduction
I neuroni del sistema nervoso centrale adulto (SNC) hanno una capacità rigenerativa limitata dopo lesioni o malattie. Una strategia comune per promuovere la rigenerazione del SNC è il trapianto, nel sito delle lesioni, di tipi cellulari che inducono la crescita assonale come cellule staminali, cellule di Schwann, astrociti o cellule olfattive glia (OEG)1,2,3,4,5.
OEG deriva dalla cresta neurale6 e si trova nella mucosa olfattiva e nel bulbo olfattivo. Nell’adulto, i neuroni sensoriali olfattivi muoiono regolarmente a causa dell’esposizione ambientale e vengono sostituiti da neuroni appena differenziati. OEG circonda e guida questi nuovi assoni olfattivi per entrare nel bulbo olfattivo e stabilire nuove sinapsi con i loro obiettivi nel CNS7. A causa di questi attributi fisiologici, l’OEG è stato utilizzato in modelli di lesione del SNC come midollo spinale o lesione del nervo ottico e le sue proprietà neuroregenerative e neuroprotettivediventano dimostrate 8,9,10,11. Diversi fattori sono stati identificati come responsabili delle caratteristiche pro-rigenerative di queste cellule, tra cui la produzione o la secrezione di fattori di crescita neurotrofica e assonale12,13,14.
Date le limitazioni tecniche per espandere le cellule OEG primarie, abbiamo precedentemente stabilito e caratterizzato linee clonali OEG umane immortalate reversibili (ihOEG), che forniscono una fornitura illimitata di OEG omogeneo. Queste cellule ihOEG derivano da colture primarie, preparate da bulbi olfattivi ottenuti in autopsie. Sono stati immortalati per trasduzione della subunità catalitica telomerasi (TERT) e dell’oncogene Bmi-1 e modificati con il virus SV40 grande antigene T15,16,17,18. Due di queste linee cellulari ihOEG sono Ts14, che mantiene la capacità rigenerativa delle colture originali e Ts12, una linea rigenerativa bassa che viene utilizzata come basso controllo di rigenerazione in questi esperimenti18.
Per valutare la capacità dell’OEG di favorire la rigenerazione assonale dopo la lesione neurale, sono stati implementati diversi modelli in vitro. In questi modelli, l’OEG viene applicato a colture di diversa origine neuronale e vengono saggiate la formazione e l’allungamento della neurite, in risposta alla cocoltura gliale. Esempi di tali fonti neuronali sono i neuroni corticali del ratto neonatale19, le ferite da graffio eseguite sui neuroni embrionali del ratto dal tessutocorticale 20,le espianto retinichedel ratto 21, i neuroni postnatali ipotalamici o ippocampali del ratto22,23, neuroni ganglionali della radice dorsale del ratto postnatale24, neuroni del tratto corticospinale del topo postnatale25,neuroni NT2umani 26o neuroni corticali cerebrali postnatali su colture reattive simili a cicatrici astrociti27.
In questi modelli, tuttavia, il test di rigenerazione si basa su neuroni embrionali o postnatali, che hanno una plasticità intrinseca che è assente nei neuroni adulti feriti. Per superare questo inconveniente, presentiamo un modello di rigenerazione assonale adulta in coculture di linee OEG con neuroni ganglionali retini adulti (RGN), basato su quello originariamente sviluppatoda Wigley etal. In breve, il tessuto retinale viene estratto da ratti adulti e digerito con papaina. La sospensione cellulare retinica viene quindi placcata su coverlips trattate con polilisina o su monostrati Ts14 e Ts12. Le colture vengono mantenute per 96 ore prima di essere fissate e quindi viene eseguita l’immunofluorescenza per i marcatori assonale (proteine MAP1B e NF-H)34 e somatodendritica (MAP2A e B)35 marcatori. La rigenerazione assonale è quantificata come percentuale di neuroni con assone, rispetto alla popolazione totale di RGN e l’indice di rigenerazione assonale è calcolato come lunghezza assonale media per neurone. Questo protocollo non è solo utile per valutare il potenziale neuroregenerativo di ihOEG, ma può essere esteso a diverse fonti di OEG o altre cellule gliali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il trapianto OEG nei siti di lesione del SNC è considerato una terapia promettente per la lesione del SNC a causa delle sue proprietà pro-neuroregenerative costitutive7,8,9. Tuttavia, a seconda della sorgente tissutale — mucosa olfattiva (OM-OEG) rispetto al bulbo olfattivo (OB-OEG) — o dell’età del donatore, esistono notevoli variazioni in talecapacità 26,31<sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal progetto SAF2017-82736-C2-1-R dal Ministerio de Ciencia e Innovación al MTM-F e dalla Fundación Universidad Francisco de Vitoria a JS.
Materials
| antibody 514 | Reference 34 | Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B. | |
| antibody SMI-31 | BioLegend | 801601 | Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins |
| anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher | A-21202 | |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma | 283967 | NMDA receptor inhibitor |
| DAPI | Sigma | D9542 | Nuclei fluorescent stain |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | Cell culture medium |
| FBS | Gibco | 11573397 | Fetal bovine serum |
| FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | Fetal bovine serum |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | Mounting medium |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH-USA) | Image software | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605F | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Neuronal cells culture medium |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | For use in neural cell isolation |
| PBS | Home made | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Bacteriostatic and bactericidal |
| Pituitary extract | Gibco | 13028014 | Bovine pituitary extract |
| Poly -L- lysine (PLL) | Sigma | A-003-M |
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