Desarrollamos un método simple para aislar las células individuales de alta calidad del corazón del ratón por la técnica anterógrada de la perfusión. Este método está libre de Langendorff y es útil para aislar miocitos ventriculares y auriculares o células intersticiales, como fibroblastos cardíacos o progenitores.
En la investigación básica con corazón de ratón, aislar cardiomiocitos individuales viables es un paso técnico crucial a superar. Tradicionalmente, el aislamiento de cardiomiocitos de conejos, conejillos de Indias o ratas se ha realizado a través de la perfusión retrógrada del corazón con enzimas utilizando un aparato de Langendorff. Sin embargo, se requiere un alto grado de habilidad cuando este método se utiliza con un pequeño corazón de ratón. Un método anterógrado de la perfusión que no utiliza un aparato de Langendorff fue divulgado recientemente para el aislamiento de los cardiomyocytes del ratón. Adjunto divulgamos un protocolo completo para la perfusión anterógrada mejorada del corazón suprimido para aislar las células de corazón individuales de los ratones adultos (8 – 108 semanas de viejo). La perfusión anterógrada se realiza mediante la inyección de perfusato cerca del ápice del ventrículo izquierdo del corazón extirpado, cuya aorta se sujetó, utilizando una bomba de infusión. Todos los procedimientos se llevan a cabo en una estera calentadora precalentada bajo un microscopio, lo que permite monitorear los procesos de inyección y perfusión. Los resultados sugieren que los miocitos ventriculares y atriales, y los fibroblastos se puedan aislar bien de un solo ratón adulto simultáneamente.
Generalmente, el primer paso del aislamiento unicelular del tejido diseccionado implica mincing el tejido en pedazos pequeños, seguido por la digestión del tejido conectivo y de la matriz extracelular con las enzimas. Sin embargo, los cardiomiocitos no se pueden aislar con un método de corte, ya que el enriquecimiento con componentes de la matriz extracelular, incluidas las fibras de colágeno y elastina, hace que el miocardio sea demasiado resistente a la picada, y los cardiomiocitos son altamente sensibles a la hipoxia y otros cambios en el microambiente. Así, utilizando el sistema de perfusión retrógrada basado en Langendorff1,se ha desarrollado un método de digestión de la matriz extracelular con enzimas para aislar cardiomiocitos individuales delcorazón 2,3,4.
En modelos de ratón, la perfusión retrógrada basada en Langendorff del corazón con enzimas también se utiliza para el aislamiento de cardiomiocitos individuales5,6,7,8. Sin embargo, la canulación de la aorta de ratón pequeña y delgada y su montaje en el aparato de Langendorff para realizar la perfusión retrógrada requiere un alto grado de habilidad, ya que el diámetro de la aorta en el corazón adulto es de aproximadamente 1,2 mm. Además, se necesita tiempo para realizar múltiples experimentos como el aparato De Langendorff debe ser limpiado antes de perfundir el siguiente corazón.
Como alternativa a la perfusión retrógrada, un método nuevo para aislar cardiomyocytes de un corazón adulto del ratón sin un aparato de Langendorff fue desarrollado. Este método de creación de época se basó en la perfusión anterógrada de las arterias coronarias9. Recientemente mejoramos cada paso de este protocolo anterógrado, como el pinzamiento de la aorta, la inserción de agujas y el control de temperatura, y monitoreamos todos los procedimientos de perfusión con un microscopio10. Adjunto divulgamos detalladamente el refinamiento de este método anterógrado de la perfusión para acortar el tiempo para el aislamiento y para proporcionar un vídeo suplemental. En este método, la perfusión del corazón toma aproximadamente 7 minutos con 10 mL de las enzimas, y este corto período de digestión aumenta la viabilidad de las células. Este es un método simple para aislar las células cardíacas individuales a una alta calidad sin necesidad de la adición de sustancias químicas, tales como 2,3-butanodiona monoxima (BDM)6,11 o taurina5,8. Creemos que este método reducirá el umbral de habilidad de la técnica y mejorar la utilidad de los cardiomiocitos de ratón en la investigación básica.
Dado que el corazón es altamente susceptible a la isquemia, el tiempo necesario para extirpar el corazón y sumergirlo en CIB-EGTA helado para detener la contracción debe mantenerse corto como sea posible (<1 min). Este es el primer paso crítico de este método. El segundo paso crítico se refiere a la dirección del corazón. La orientación particular del corazón extirpado en el paso 2.1.2 facilita la vista y la eliminación de la grasa y los tejidos conectivos alrededor de la aorta. Después de limpiar alrededor de la aorta, coloque el corazón sujeto con el lado de la superficie anterior hacia arriba en la placa de perfusión. El paso crítico final implica la inserción de la aguja de inyección. Al avanzar la aguja hacia el corazón, la aguja de inyección no debe desprenderse de la placa de perfusión para mantener una distancia constante de la placa. La posición de la inserción está cerca del ápice del ventrículo izquierdo. Inserte la aguja cuidadosamente sin torcer, ya que dicha torsión puede agrandar el agujero. La profundidad de la inserción de la aguja se puede estimar observando la marca roja. Si la aguja se inserta demasiado profundo, la punta puede perforar a través del tabique ventricular y entrar en el ventrículo derecho o a través de la válvula mitral y entrar en la aurícula izquierda. Después de confirmar la desaparición de la sangre de la arteria coronaria, la aguja se debería fijar con la cinta a la placa de la perfusión.
Una longitud de aorta más larga hace que sea difícil sujetar la aorta en la posición correcta. Si la abrazadera está demasiado distante de las aurículas, el corazón puede girar después de la infusión de perfusato. Para prevenir esto, corte la aorta justo debajo de la arteria braquiocefálica para acortar la aorta antes de sujetarse.
Si la sangre no comienza a descargarse después de la perfusión a una velocidad inicial de 0,5 mL/min, aumente la velocidad a 1 mL/min. Si eso no ayuda, la aguja de inyección puede colocarse incorrectamente, como en el ventrículo derecho, el tabique ventricular o la pared miocárdica izquierda. En tal caso, retire la aguja inmediatamente y trate de volver a insertarla cerca del ápice del ventrículo izquierdo. Al insertar la aguja varias veces, las células digeridas pueden fluir fuera de los agujeros abiertos. Tenga en cuenta que esto no suele afectar seriamente el aislamiento celular.
Los operadores pueden monitorear todo el proceso de perfusión anterógrada del corazón utilizando un microscopio estereoscópico para observar los cambios de color y transparencia y reiniciar el latido de las aurículas junto con la digestión. Un total de 10 mL de mezcla de enzimas debe ser el máximo requerido, incluso para un corazón viejo. En corazones más jóvenes (5-7 semanas de edad), reducimos el volumen a 9 mL, que es similar al enfoque a través de la perfusión retrógrada con la misma mezcla de enzimas.
El sobrenadante en la centrifugación final contiene escombros, células sanguíneas y no miocitos, mientras que el pellet contiene principalmente cardiomiocitos y no miocitos contaminantes, como fibroblastos y células endoteliales. Para purificar los cardiomiocitos, se necesitan más pasos. En general, el pellet debe resuspended en el medio de cultivo celular apropiado y preplated durante 2 h a 37 °C en un plato de cultivo celular de tejido, y luego eliminar suavemente los cardiomiocitos por pipeteo y preplating para el cultivo.
La mezcla enzimática contiene una baja concentración de Ca2+ (0,3 mM). Por lo tanto, incubamos células digeridas en CIB-Ca2+-BSA (1,2 mM Ca2+)antes de la resuspensión final con la solución de resuspensión celular (1,8 mM Ca2+),y el aumento gradual de Ca2+ evita causar daño celular7. Mientras los cardiomiocitos aislados estén intactos (células quietas sin contracción) este procedimiento de adaptación de Ca2+no afecta la viabilidad celular en ratones. Como las células dañadas están muriendo durante esta incubación, en consecuencia obtenemos un grupo celular sano. Del mismo modo, los miocitos auriculares intactos aislados (células quietas sin contracción irregular) se pueden almacenar en la misma solución de resuspensión celular. Sin embargo, los miocitos auriculares tienden a ser más delicados para ser almacenados en comparación con los miocitos ventriculares.
En el laboratorio, este método de aislamiento es casi siempre exitoso a menos que la inserción de la aguja en el ventrículo izquierdo falle. También hemos tenido éxito en aislar las células del corazón hipertrofiado preparado por la constricción aórtica transversal quirúrgica. Sin embargo, en ratones envejecidos, que a menudo tienen pequeños infartos de miocardio, la perfusión cesa en algunos lugares, lo que resulta en una digestión incompleta y, por lo tanto, un bajo rendimiento(Figura 1C),similar al método retrógrado basado en Langendorff. En tales casos, la forma distorsionada del corazón se puede observar incluso al comienzo de la perfusión.
Este método de perfusión anterógrada es útil para aislar las células cardíacas de ratones de varias edades, pero no de animales más grandes, como conejos y conejillos de Indias. Puede ser posible aplicar este método a ratas neonatales o juveniles antes del destete.
Una de las ventajas de este método de perfusión anterógrada es que disminuye los obstáculos técnicos asociados con el uso del método de perfusión retrógrada basado en Langendorff para corazones de ratón pequeños. El tiempo requerido para la perfusión es de aproximadamente 7 min con 10 mL de las enzimas, este corto período de digestión aumenta la viabilidad de las células. Además, permite realizar la perfusión a través de la circulación coronaria del corazón, incluso después de que las válvulas aórticas hayan sido digeridas. El aislamiento de los miocitos auriculares generalmente requiere perfusión retrógrada basada en Langendorff y una mayor incubación con enzimas17. Este acercamiento anterógrado de la perfusión, sin embargo, puede perfundir profundamente el tejido con la enzima para aislar miocitos atriales.
En experimentos con múltiples ratones, el aparato de Langendorff debe limpiarse antes de perfundir el siguiente corazón. Sin embargo, en el método anterógrado actual, siempre que el número deseado de conjuntos de instrumentos (por ejemplo, jeringas agujas y placas de perfusión) se preparen de antemano, la perfusión se puede realizar continuamente.
Adjunto divulgamos la metodología básica de la perfusión anterógrada del corazón del ratón usando las mismas soluciones que el método retrógrado Langendorff-basado de la perfusión sin los productos químicos adicionales. La composición del perfusato puede ser cambiada para adaptarse al propósito del experimento, como el uso de un detergente que contiene EGTA en lugar de las enzimas para hacer un corazón descelularizado18.
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a T. Yamamoto y Y. Mori por su ayuda en los experimentos morfológicos. Este trabajo fue apoyado por una Beca de Ayuda para la Investigación Científica (C) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (18K06871 a M.O.K. y 17K08536 a H.M.).
Amphotericin B | Wako Pure Chemical Industries, Japan | ||
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes, USA | A11001 | Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-α-actinin (ACTN) | Sigma-Aldrich, USA | A7811 | Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-atrial natriuretic peptide (ANP) | Merck-Millipore, USA | AB5490-I | Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots) |
Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Cell Signaling Technology, USA | 2118 | Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
Anti-smooth muscle actin (SMA) | Dako, Denmark | M0851 | Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining) |
Anti-rabbit IgG antibody | Amersham, GE Healthcare, USA | NA934 | Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
ATP disodium salt | Sigma-Aldrich, USA | A26209 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A9418 | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Biological material for adhesion of the cell or tissues |
Chemi-Lumi One Super | Nacalai Tesque, Japan | 02230-14 | Chemiluminescent reagent used for western blotting. |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemicals, USA | LS004176 | Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg. |
Complete Mini | Roche, Germany | 11836153001 | A mixture of several protease inhibitors. |
4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Nacalai Tesque, Japan | 11034-56 | Used for cell-impermeant nuclear stainig |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Nacalai Tesque, Japan | 08458-45 | including 4.5 g/L gluose |
Extension tube | Top, Japan | X1-50 | Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion. |
EPC-8 patch-clamp amplifier | HEKA, Germany | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, USA | F7524-500ML | |
Glass capillaries | Narishige Scientific Instrument Lab., Japan | outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm | |
GTP lithium salt | Sigma-Aldrich, USA | G5884 | |
Horizontal microelectrode puller | Germany) | P-97 | |
Heater mat | Natsume Seisakusho, Japan | KN-475-3-40 | Equipment to warm the perfusion plate. |
Infusion pump | TERUMO, Japan | TE-311 | Infusion syringe pump for antegrade perfusion. |
Injeciton needle (27 gauge) | TERUMO, Japan | NN-2719S | Needle for insertion into the left ventricle. |
Insulin (from bovine pancrease) | Sigma-Aldrich, USA | I5500 | Dissolve in 0.1 M HCl. |
Mini cordless grinder | Funakoshi, Japan | cG-4A | Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube. |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA) | Nacalai Tesque, Japan | 09154-85 | |
Penicillin G potassium | Nacalai Tesque, Japan | 26239-84 | |
Phenol Red | Nacalai Tesque, Japan | 26807-21 | |
10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS) | Nacalai Tesque, Japan | 27575-31 | |
Plastic multi-well culture plate | Falcon, USA | 353226 | Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate. |
Plastic syringe (20 mL) | TERUMO, Japan | SS-20ES | Use for infusion of CIB-EGTA. |
Plastic syringe (30 mL) | TERUMO, Japan | SS-30ES | Use for infusion of Enzyme-mix |
Plastic transfer pipette | Sarstedt, Germany | 86.1171 | Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette. |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck-Millipore, USA | IPVH00010 | Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting) |
Protease | Sigma-Aldrich, USA | P5147 | A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease. |
4X Sample buffer solution | Fuji Film, Japan | 198-13282 | Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB |
SDS polyacrylamide gel (15%) | Fuji Film, Japan | 193-14991 | |
Streptomycin sulfate | Nacalai Tesque, Japan | 32237-14 | |
10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG) | Nacalai Tesque, Japan | 09422-81 | Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3) |
Trypsin | Sigma-Aldrich, USA | T8003 | Trypsin from bovine Type 1. |
Vascular clamp | Karl Hammacher GmbH, Germany | HSE 004-35 | Small straight vascular clamp used for clamping aorta. |
All other reagents | Nacalai Tesque, Japan |