Il protocollo descrive le espianto organotipiche della neuroretina deltopo,coltivate insieme al suo epitelio pigmentato retinico (RPE), in mezzo definito R16, privo di siero e antibiotici. Questo metodo è relativamente semplice da eseguire, meno costoso e dispendioso in termini di tempo rispetto agli esperimenti in vivo, e può essere adattato a numerose applicazioni sperimentali.
Nella ricerca oftalmica, c’è un forte bisogno di modelli in vitro della neuroretina. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per la 150% organotipico della neuro retina deltopo con epitelio pigmentato retinico intatto (RPE). A seconda della domanda di ricerca, le retine possono essere isolate da animali di tipo selvatico o da modelli di malattia, per studiare, ad esempio, la retinopatia diabetica o la degenerazione retinica ereditaria. Gli occhi dei primi giorni postnatali 2-9 animali vengono enucleati in condizioni asettiche. Sono parzialmente digeriti nella proteinasi K per consentire un distacco del coroide dall’RPE. Sotto lo stereoscopio, una piccola incisione viene fatta nella cornea creando due bordi da cui la coroide e la sclera possono essere delicatamente staccate dall’RPE e dalla neuroretina. L’obiettivo viene quindi rimosso e l’oculare viene tagliato in quattro punti per dargli una forma a quattro spicchi simile a una foglia di trifoglio. Il tessuto viene infine trasferito in una goccia appesa in un inserto di coltura cellulare che tiene una membrana di coltura in policarbonato. Le colture vengono poi mantenute in mezzo R16, senza siero o antibiotici, in condizioni completamente definite, con un cambio medio ogni secondo giorno.
La procedura descritta consente l’isolamento della retina e la conservazione del suo normale contesto fisiologico e istotipico per periodi di coltivazione di almeno 2 settimane. Queste caratteristiche rendono le colture organotipiche di espianto retino un modello eccellente ad alto valore predittivo, per studi sullo sviluppo retinale, sui meccanismi delle malattie e sull’elettrofisiologia, consentendo allo stesso tempo lo screening farmacologico.
Nella ricerca oftalmica, sono disponibili una varietà di modelli per studiare la retina, tra cui colture primarie di cellule retiniche, linee cellulari derivate dalla retina, organoidi retinali e modelli animali in vivo1,2,3,4,5. Tuttavia, ognuno di questi modelli soffre di svantaggi. Ad esempio, le cellule crescono in isolamento mentre la retina è una rete complessa con una moltitudine di interazioni cellula-cellula. Pertanto, è probabile che il comportamento delle colture cellulari isolate sia artificiale rispetto a quello osservato in un intero tessuto. Questo problema può essere in parte risolto utilizzando organoidi retinali differenziati in vitro, che possono essere utilizzati per studiare lo sviluppo e la biologia di base6. Tuttavia, ad oggi, la generazione organoide retinica richiede ancora molto tempo, richiede molto lavoro e soffre di problemi di riproducibilità, richiedendo un ulteriore lavoro di sviluppo sostanziale prima che gli organoidi possano essere utilizzati per la ricerca retinica traslizionale. Infine, gli studi sugli animali vivi, mentre probabilmente il modello più vicino alle esigenze della ricerca oftalmica, sono associati a forti preoccupazioni etiche. Un buon compromesso tra l’efficienza dei sistemi di coltura cellulare e la situazione reale dei modelli animali in vivo sono colture organotipiche di espianto retino. Tali colture riducono anche la sofferenza degli animali poiché non vengono eseguiti interventi in vivo.
Sono stati descritti diversi metodi per coltivare espianto retinale di diverse specie5,7,8. Il nostro protocollo descrive una tecnica per l’isolamento della neuroretina del topo insieme al suo epitelio pigmentato retinico (RPE). Questa tecnica sarà adatta anche per colture retiniche di ratto9. La cultura della neuroretina insieme al suo RPE è di grande importanza per il successo. L’RPE svolge funzioni essenziali per la retina: trasporto di nutrienti, ioni, acqua, assorbimento della luce e protezione contro la fotoossidazione, reisomerazione dell’all-trans-retinica in 11-cis-retinica, che è fondamentale per il ciclo visivo, fagocitosi delle membrane fotorecettori a spargimento e secrezione di fattori essenziali per l’integrità strutturale della retina10. Il mantenimento dell’RPE consente uno sviluppo riuscito dei segmenti esterni ed interni del fotorecettore, mantenendo la retina vitale per un tempo più lungo11. La procedura descritta di seguito conserva le caratteristiche istotipiche e fisiologiche della retina per almeno due settimane12. Inoltre, coltivare le espianto retiniche organotipiche in mezzo privo di siero e privo di antibiotici evita la presenza di sostanze sconosciute e consente una semplice interpretazione dei risultati12.
Le colture organotipiche di espianto retino sono state essenziali per migliorare le nostre conoscenze sullo sviluppo retinale e sulla degenerazione7,13,14. Mostriamo qui che sono anche uno strumento utile per lo screening farmacologico e che possono essere utilizzati per modellare una varietà di malattie retiniche, compresa la retinopatia diabetica.
Il protocollo presentato descrive colture organotipiche di estipe di retina di topo con RPE intatto in mezzo R16 definito, privo di siero e antibiotici. Questo protocollo è stato originariamente sviluppato a partire dalla fine degli anni ’807,28 e da allora è stato continuamenteperfezionato 6,11,12. Tra le applicazioni degne di nota figurano studi sui meccanismi della degenerazione retinica ereditaria e l’identificazione dei farmaci retinoprotettivi23,29,30.
Per un esperimento riuscito, è necessario prendere in considerazione alcune considerazioni importanti. Ecco alcuni importanti punti di risoluzione dei problemi per migliorare la qualità delle culture. In primo luogo, le colture retiniche possono mostrare un’eccessiva piegatura e/o formazione di rosetta31. Ciò può essere causato toccando la retina con una forza durante la procedura di espianto. Inoltre, il corpo ciliario deve essere completamente rimosso dall’espianto, in quanto ciò può aumentare la piegatura retinica durante la coltura. In secondo luogo, durante il trasferimento della retina alla piastra del pozzo in una goccia sospesa, se la retina si affaccia sulla membrana il lato sbagliato verso il basso, tienila nella goccia appesa alla punta della pipetta e spingi molto delicatamente il mezzo in uscita dalla punta (senza staccare la goccia appesa) per capovolgere la retina. Infine, se l’RPE rimane attaccato alla sclera e si stacca dalla retina, è molto probabilmente causato da una predigestione insufficiente della sclera. Questo problema potrebbe essere particolarmente importante quando si lavora con gli occhi di animali più anziani o specie non roditori (ad esempio suini) e può essere risolto aumentando la concentrazione di proteinasi K.
Condurre colture organotipiche di espianto retiniche è una procedura complessa che richiede un’adeguata formazione ed esperienza. La mancanza di formazione può portare alla variabilità nella qualità delle espianto retiniche. Per questi motivi, è importante monitorare e verificare la fattibilità e la riproducibilità, caratterizzando, ad esempio, il tasso di morte cellulare con il saggio TUNEL. L’uso di un mezzo privo di antibiotici rende gli espianto retiniche vulnerabili alla contaminazione da batteri e funghi. Per ridurre al minimo questo rischio, si consiglia di prestare particolare attenzione a lavorare in condizioni veramente asettiche. Un’altra limitazione della coltura retinica in vitro sono le differenze nell’ambiente fisiochimico rispetto alla retina in vivo (ad esempio, apporto di sangue coroio e retinico, livelli di ossigeno e glucosio, pressione intraoculare, composizione del vitreo). Un sistema di perfusione continua, forse incorporato in un bioreattorededicato 32, potrebbe rendere questo modello più vicino alla condizione in vivo. Inoltre, l’assotomia del nervo ottico durante la dissezione retinica porterà alla morte delle cellule gangliari, che può indurre risposte allo stress8. Pertanto, è consigliabile lasciare che l’espianto sia lasciato ad adattarsi alle condizioni di coltura per almeno 2 giorni in vitro prima di essere sottoposto a una manipolazione o a un trattamento specifico.
Il metodo descritto viene solitamente eseguito su tessuti retinali immaturi, che possono sopravvivere bene per 4 settimane in vitro7,33. Tuttavia, la procedura è adattabile a una varietà di applicazioni, tra cui la ristrutturazione della retina adulta. Sebbene diversi approcci pubblicati descrivano l’isolamento della retina adulta senza il suo RPE34,35, l’incubazione con soluzione di papaina per un massimo di 1 h a 37 °C prima della dissezione consente all’RPE di rimanere attaccato alla retina anche se derivato da un topo adulto36.
Il mezzo privo di siero e l’ambiente in vitro definito chimicamente prevedono una manipolazione completamente definita e riproducibile delle condizioni sperimentali. Pertanto, le colture organotipiche di espianto retiniche sono strumenti preziosi nel campo dell’oftalmologia e delle neuroscienze e sono state utilizzate per lo studio delle malattie retiniche37,lo sviluppo della retina38,39,la terapia delle cellule staminali retiniche40,le modifichegenetiche 41e lo screening farmacologico. Come esempio specifico di test farmacologici, qui abbiamo usato colture di espianto retinale per testare un analogo cGMP (CN003), noto per ridurre la morte cellulare del fotorecettore nei modelli animali per la malattia retinicaereditaria 23 (Figura 3B). Un’altra possibile applicazione della tecnica è descritta nella figura 3C, che illustra come il controllo preciso dell’ambiente tissutale possa essere sfruttato per emulare le condizioni diabetiche24. A causa della conservazione dell’architettura tissutale durante l’intero periodo di coltura, le colture organotipiche di espianto retinico sono adatte anche per studi elettrofisiologici. La funzionalità neuronale sulle espianto retiniche è stata studiata utilizzando la registrazione patch-clamp42 e la registrazione multi-elettrodo-array (MEA)33,43. Quest’ultimo consente la registrazione dell’attività elettrica delle popolazioni neuronali allo stesso tempo ed è stato sfruttato per caratterizzare la funzionalità del fotorecettore e della cellula ganglionaria in condizioni di coltura. In una prospettiva più ampia, i sistemi di coltura organotipica delle espianto possono essere applicati anche nella ricerca pre-clinica, dove le colture di espianto sono state utilizzate per testare l’efficacia terapeutica dell’ipotermia44.
La tecnica di coltivazione organotipico delle espianto è relativamente semplice da eseguire e, rispetto ai corrispondenti esperimenti in vivo, è meno costosa e dispendiosa in termini di tempo ed evita le preoccupazioni etiche legate agli studi sugli animali vivi. Il controllo preciso sulle condizioni sperimentali e la conservazione della complessità dell’RPE e dei tessuti rendono il metodo uno strumento prezioso per migliorare le nostre conoscenze sulla fisiologia retinica e la fisiopatologia e consentire numerose applicazioni sperimentali.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro di ricerca ha ricevuto un sostegno finanziario dall’Unione europea (transMed; H2020-MSCA-765441), il Consiglio tedesco delle ricerche (DFG; PA1751/8-1, 10-1) e il Consiglio delle borse di studio per la Cina.
Biotin | Sigma | B4639 | |
(+/-)-α-LipoicAcid (=Thiotic acid) | Sigma | T1395 | |
BSA | Sigma | B4639 | |
CDP-Choline-Na | Sigma | 30290 | |
Corticosterone | Sigma | C2505 | |
CuSO4 × 5H2O | Sigma | C8027 | |
DL-Tocopherol | Sigma | T1539 | |
Ethanolamine | Sigma | E0135 | |
FCS | Sigma | F7524 | |
Filtropur BT100, 1L, 0.2µm | SARSTEDT | 83.3942.101 | for Basal Medium |
Forceps | F.S.T | 15003-08 | |
Glutamine | Sigma | G8540 | |
Glutathione | Sigma | G6013 | |
Insulin | Sigma | I6634 | |
L-CysteineHCl | Sigma | C7477 | |
Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
MnCl2 x 4H2O | Sigma | M5005 | |
Na-pyruvate | Sigma | P3662 | |
NaSeO3 x 5H2O | Sigma | S5261 | |
Ophthalmic microscope scaping spoon | F.S.T. | 10360-13 | |
Progesteron | Sigma | P8783 | |
Proteinase K | MP Biomedicals | 21935025 | 44 mAnson U/mg |
R16 | Gibco | 07491252A | |
Retinol | Sigma | R7632 | |
Retinyl acetate | Sigma | R7882 | |
Scissors | F.S.T | 15004-08 | |
Sterile filter 0.22µm | MILLEX GP | SLGP033RS | for supplements |
T3 | Sigma | T6397 | |
Tocopherylacetate | Sigma | T1157 | |
Transferrin | Sigma | T1283 | |
Transwell permeable supports | Corning | 3412 | |
Vitamin B1 | Sigma | T1270 | |
Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
Vitamin C | Sigma | A4034 |