Protokollet beskriver organotypiska explanter av mus neuronäthinnan, odlas tillsammans med dess retinal pigment epitel (RPE), i R16 definierade medium, fria från serum och antibiotika. Denna metod är relativt enkel att utföra, billigare och tidskrävande jämfört med in vivo-experiment, och kan anpassas till många experimentella applikationer.
Inom oftalmisk forskning finns det ett starkt behov av in vitro-modeller av neuroretina. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för organotypisk odling av mus neuronäthinnan med intakt retinal pigment epitel (RPE). Beroende på forskningsfrågan kan näthinnedjur isoleras från vilda djur eller från sjukdomsmodeller, för att studera till exempel diabetiker retinopati eller ärftlig retinal degeneration. Ögon från tidig postnatal dag 2-9 djur är enucleated under aseptiska förhållanden. De smälts delvis i proteinas K för att möjliggöra en avlossning av choroiden från RPE. Under stereoskopet görs ett litet snitt i hornhinnan som skapar två kanter varifrån choroid och sclera försiktigt kan skalas av från RPE och neuroretina. Linsen avlägsnas sedan, och ögonkoppen skärs i fyra punkter för att ge den en fyrakilad form som liknar ett klöverblad. Vävnaden överförs slutligen i en hängande droppe i en cellkulturinsättning som håller ett polykarbonatodlingsmembran. Kulturerna upprätthålls sedan i R16 medium, utan serum eller antibiotika, under helt definierade förhållanden, med en medelförändring varannan dag.
Förfarandet beskrivs möjliggör isolering av näthinnan och bevarandet av dess normala fysiologiska och histotypiska sammanhang för odling perioder på minst 2 veckor. Dessa funktioner gör organotypiska retinal explant kulturer en utmärkt modell med högt prediktivt värde, för studier i retinal utveckling, sjukdom mekanismer och elektrofysiologi, samtidigt som möjliggör farmakologisk screening.
I oftalmisk forskning finns en mängd olika modeller tillgängliga för att studera näthinnan, inklusive primära näthinnecellkulturer, näthinnan-härledda cellinjer, näthinneorganoider och in vivo-djurmodeller 1,2,3,4,5. Men var och en av dessa modeller lider av nackdelar. Till exempel växer celler isolerat medan näthinnan är ett komplext nätverk med en mängd cell-till-cell-interaktioner. Således är beteendet hos isolerade cellkulturer sannolikt artificiellt jämfört med det som observerats i en hel vävnad. Detta problem kan delvis åtgärdas med hjälp av in vitro differentierade retinal organoider, som kan användas för att studera utveckling och grundläggandebiologi 6. Men från och med idag är retinal organoidgeneration fortfarande tidskrävande, arbetsintensiv och lider av reproducerbarhetsproblem, vilket kräver betydande ytterligare utvecklingsarbete innan organoider kan användas för translationell näthinneforskning. Slutligen är studier på levande djur, även om modellen som kommer närmast kraven på oftalmisk forskning, förknippad med starka etiska problem. En bra kompromiss mellan cellkultursystemens effektivitet och den verkliga situationen för in vivo-djurmodeller är organotypiska retinala explantkulturer. Sådana kulturer minskar också djurs lidande eftersom inga in vivo-interventioner utförs.
Flera metoder har beskrivits för odling av retinal explanter från olika arter5,7,8. Vårt protokoll beskriver en teknik för isolering av musen neuroretina tillsammans med dess retinal pigment epitel (RPE). Denna teknik kommer också att vara lämplig för rått retinal kulturer9. Neuroretinakulturen tillsammans med dess RPE är av stor betydelse för framgång. RPE utför väsentliga funktioner för näthinnan: transport av näringsämnen, joner, vatten, absorption av ljus och skydd mot fotooxidation, re-isomerisering av all-trans-retinal till 11-cis-retinal, vilket är avgörande för den visuella cykeln, faagocytos av skjulfotoreceptormembran och utsöndring av väsentliga faktorer för näthinnans strukturella integritet10. Underhåll av RPE möjliggör en framgångsrik utveckling av fotoreceptorns yttre och inre segment, vilket håller näthinnan livskraftig under en längre tid11. Förfarandet som beskrivs nedan bevarar näthinnans histotypiska och fysiologiska egenskaper under minst två veckor12. Dessutom undviker odling av organotypiska retinala explanter i serumfritt, antibiotikafritt medium förekomsten av okända ämnen och möjliggör en enkel tolkning av resultaten12.
Organotypiska retinal explant kulturer har varit avgörande för att förbättra vår kunskap om retinal utveckling och degeneration7,13,14. Vi visar här att de också är ett användbart verktyg för farmakologisk screening och att de kan användas för att modellera en mängd olika näthinnesjukdomar, inklusive diabetes retinopati.
Protokollet som presenteras beskriver organotypiska explant kulturer av mus näthinnan med intakt RPE i definierade R16 medium, fria från serum och antibiotika. Detta protokoll utvecklades ursprungligen från slutet av 1980-talet7,28 och sedan dess har det kontinuerligt förfinats6,11,12. Anmärkningsvärda tillämpningar inkluderar studier av mekanismerna för ärftlig retinal degeneration och identifiering av retinoprotektivaläkemedel 23,29,30.
För ett framgångsrikt experiment måste vissa viktiga överväganden beaktas. Här är några viktiga felsökningspunkter som hjälper till att förbättra kvaliteten på kulturer. För det första kan näthinnekulturerna uppvisa överdriven vikning och/eller rosettbildning31. Detta kan orsakas genom att röra näthinnan med en tång under explanteringsproceduren. Dessutom måste ciliary kroppen helt avlägsnas från explanten, eftersom detta kan öka näthinnans vikning under kulturen. För det andra, under överföringen av näthinnan till brunnsplattan i en hängande droppe, om näthinnan vetter mot membranet på fel sida ner, håll den i droppen hängande från pipettspetsen och tryck försiktigt mediet in och ut ur spetsen (utan att lossa den hängande droppen) för att vända näthinnan runt. Slutligen, om RPE förblir fäst vid sclera och lossnar från näthinnan, orsakas det sannolikt av en otillräcklig predigestion av sclera. Detta problem kan vara särskilt viktigt när man arbetar med ögon från äldre djur eller icke-gnagare (t.ex. grisar) och kan lösas genom att öka proteinas K-koncentrationen.
Att genomföra organotypiska retinala explantkulturer är ett komplext förfarande som kräver adekvat utbildning och erfarenhet. Brist på utbildning kan leda till variation i kvaliteten på retinal explanterna. Av dessa skäl är det viktigt att övervaka och verifiera livskraft och reproducerbarhet, vilket till exempel kännetecknar celldödshastigheten med TUNEL-analysen. Användningen av ett antibiotikafritt medium gör retinal explanterna sårbara för kontaminering av bakterier och svampar. För att minimera denna risk rekommenderar vi att särskild försiktighet vidtas för att arbeta under verkligt aseptiska förhållanden. En annan begränsning av in vitro retinal odling är skillnader i fysiokemisk miljö jämfört med in vivo näthinnan (t.ex. choroidal och näthinneblodtillförsel, syre och glukosnivåer, intraokulärt tryck, sammansättning av glaskroppen). Ett kontinuerligt perfusionssystem, kanske inbäddat i en dedikerad bioreaktor32, kan göra denna modell närmare in vivo-tillståndet. Dessutom kommer axotomin hos synnerven under retinal dissekering att leda till ganglioncelldöd, som kan inducerastressresponser 8. Därför rekommenderas att explanten lämnas att anpassa sig till odlingsförhållandena i minst 2 dagar in vitro innan den utsätts för en specifik manipulering eller behandling.
Den beskrivna metoden utförs vanligtvis på omogna näthinnevävnader, som kan överleva bra i 4 veckor in vitro7,33. Förfarandet är dock skräddarsytt för en mängd olika tillämpningar, inklusive odling av vuxen näthinna. Även om olika publicerade metoder beskriver isoleringen av den vuxna näthinnan utan dess RPE34,35, inkubationen med papainlösning i upp till 1 h vid 37 °C före dissekering tillåter RPE att förbli fäst vid näthinnan även när den härrör från en vuxen mus36.
Det serumfria mediet och den kemiskt definierade in vitro-miljön föreskriver en helt definierad och reproducerbar manipulering av försöksbetingelseförhållandena. Därför är organotypiska retinal explant kulturer värdefulla verktyg inom området oftalmologi och neurovetenskap, och har använts för att studera retinal sjukdomar37,näthinnan utveckling38,39,näthinnan stamcellsterapi40,genetiska modifieringar41, och farmakologisk screening. Som ett specifikt exempel på drogtester använde vi här retinala explantkulturer för att testa en cGMP-analog (CN003), känd för att minska fotoreceptorcelldöden i djurmodeller för ärftlig näthinnesjukdom23 (Figur 3B). En annan möjlig tillämpning av tekniken beskrivs i figur 3C, som illustrerar hur den exakta kontrollen av vävnadsmiljön kan utnyttjas för att efterlikna diabetesförhållanden24. På grund av bevarandet av vävnadsarkitektur under hela odlingsperioden är organotypiska retinal explant kulturer också lämpliga för elektrofysiologiska studier. Neuronal funktionalitet på retinal explanter har undersökts med patch-clamp inspelning42 och multi-electrode-array (MEA) inspelning33,43. Den senare tillåter registrering av elektrisk aktivitet av neuronala populationer samtidigt och har utnyttjats för att karakterisera fotoreceptor och ganglion cell funktionalitet i kulturförhållanden. I ett bredare perspektiv kan de organotypiska explantkultursystemen också tillämpas i preklinisk forskning, där explantkulturer användes för att testa den terapeutiska effekten av hypotermi44.
Den organotypiska explantodlingstekniken är relativt enkel att utföra och, jämfört med motsvarande in vivo-experiment, är billigare och tidskrävande och undviker de etiska problemen relaterade till levande djurstudier. Den exakta kontrollen över experimentella förhållanden och bevarandet av RPE och vävnadskomplexitet gör metoden till ett värdefullt verktyg för att förbättra vår kunskap om näthinnefysiologi och patofysiologi och möjliggöra många experimentella tillämpningar.
The authors have nothing to disclose.
Detta forskningsarbete fick ekonomiskt stöd från Europeiska unionen (transMed; H2020-MSCA-765441), det tyska forskningsrådet (DFG; PA1751/8-1, 10-1) och Kinas stipendieråd.
Biotin | Sigma | B4639 | |
(+/-)-α-LipoicAcid (=Thiotic acid) | Sigma | T1395 | |
BSA | Sigma | B4639 | |
CDP-Choline-Na | Sigma | 30290 | |
Corticosterone | Sigma | C2505 | |
CuSO4 × 5H2O | Sigma | C8027 | |
DL-Tocopherol | Sigma | T1539 | |
Ethanolamine | Sigma | E0135 | |
FCS | Sigma | F7524 | |
Filtropur BT100, 1L, 0.2µm | SARSTEDT | 83.3942.101 | for Basal Medium |
Forceps | F.S.T | 15003-08 | |
Glutamine | Sigma | G8540 | |
Glutathione | Sigma | G6013 | |
Insulin | Sigma | I6634 | |
L-CysteineHCl | Sigma | C7477 | |
Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
MnCl2 x 4H2O | Sigma | M5005 | |
Na-pyruvate | Sigma | P3662 | |
NaSeO3 x 5H2O | Sigma | S5261 | |
Ophthalmic microscope scaping spoon | F.S.T. | 10360-13 | |
Progesteron | Sigma | P8783 | |
Proteinase K | MP Biomedicals | 21935025 | 44 mAnson U/mg |
R16 | Gibco | 07491252A | |
Retinol | Sigma | R7632 | |
Retinyl acetate | Sigma | R7882 | |
Scissors | F.S.T | 15004-08 | |
Sterile filter 0.22µm | MILLEX GP | SLGP033RS | for supplements |
T3 | Sigma | T6397 | |
Tocopherylacetate | Sigma | T1157 | |
Transferrin | Sigma | T1283 | |
Transwell permeable supports | Corning | 3412 | |
Vitamin B1 | Sigma | T1270 | |
Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
Vitamin C | Sigma | A4034 |