Imagerie sans étiquette de la dynamique de stockage des lipides chez Caenorhabditis elegans à l’aide de la microscopie de diffusion Raman stimulée

Summary

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet l’imagerie sélective et sans étiquette de fractions chimiques spécifiques et elle a été utilisée efficacement pour imager des molécules lipidiques in vivo. Ici, nous fournissons une brève introduction au principe de la microscopie SRS et décrivons des méthodes pour son utilisation dans le stockage des lipides d’imagerie dans Caenorhabditis elegans.

Abstract

Le métabolisme des lipides est un processus physiologique fondamental nécessaire à la santé cellulaire et de l’organisme. Dysregulation du métabolisme des lipides provoque souvent l’obésité et beaucoup de maladies associées comprenant des désordres cardio-vasculaires, le diabète de type II, et le cancer. Pour faire progresser la compréhension actuelle de la régulation métabolique des lipides, les méthodes quantitatives permettant de mesurer avec précision les niveaux de stockage des lipides in vivo dans le temps et l’espace sont devenues de plus en plus importantes et utiles. Les approches traditionnelles pour analyser le stockage des lipides sont semi-quantitatives pour l’évaluation microscopique ou manquent d’informations spatio-temporelles pour la mesure biochimique. La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) est une technologie d’imagerie chimique sans étiquette qui permet une détection rapide et quantitative des lipides dans les cellules vivantes avec une résolution subcellulaire. Comme le contraste est exploité à partir de vibrations moléculaires intrinsèques, la microscopie SRS permet également un suivi quadridimensionnel des lipides chez les animaux vivants. Au cours de la dernière décennie, la microscopie SRS a été largement utilisée pour l’imagerie de petites molécules dans la recherche biomédicale et a surmonté les principales limitations des méthodes conventionnelles de coloration fluorescente et d’extraction lipidique. En laboratoire, nous avons combiné la microscopie SRS avec les outils génétiques et biochimiques disponibles pour le puissant organisme modèle, Caenorhabditis elegans, pour étudier la distribution et l’hétérogénéité des gouttelettes lipidiques à travers différentes cellules et tissus et finalement pour découvrir de nouvelles voies de signalisation conservées qui modulent le métabolisme des lipides. Ici, nous présentons les principes de travail et la configuration détaillée du microscope SRS et fournissons des méthodes pour son utilisation dans la quantification du stockage des lipides à des points de temps de développement distincts de type sauvage et de signalisation de l’insuline mutant déficient C. elegans.

Introduction

L’obésité est devenue un problème de santé mondial menaçant un tiers de la population mondiale, et elle présente un grave problème médical, étant donné son association avec une mauvaise santé mentale¹ et des maladies mortelles dont le diabète^2,les maladies^{cardiovasculaires 3} et certains types de cancer^4. L’étude du métabolisme des lipides est essentielle pour mieux comprendre les problèmes biologiques derrière l’obésité. La quantification rapide et spécifique du stockage lipidique implique la détection d’acides gras et de leurs dérivés, ainsi que de métabolites contenant des stérols, avec une sensibilité élevée et de préférence avec des informations spatiales. Les lipides sont des cibles difficiles à imager car ils manquent de fluorescence intrinsèque et ne peuvent pas être facilement marqués par fluorescence. Les étiquettes fluorescentes sont souvent plus grandes que les molécules lipidiques et, par conséquent, peuvent être chimiquement invasives et peu pratiques pour des applications in vivo. Une stratégie d’étiquetage sans étiquette ou minimale est nécessaire pour préserver la structure hydrophobe des molécules lipidiques^5. Les développements récents dans les technologies d’imagerie ont créé des opportunités passionnantes pour l’imagerie sans étiquette des lipides dans les cellules, les tissus et les organismes vivants.

Les approches traditionnelles pour les analyses de stockage de lipides dans des échantillons biologiques incluent des essais biochimiques et des protocoles de coloration avec des colorants lipophiles. Les tests de quantification biochimique impliquant la spectrométrie de masse (MS) sont inégalés dans leur résolvabilité moléculaire, mais ils nécessitent de très grandes quantités d’échantillons et la préparation des échantillons prend généralement plusieurs heures, limitant leur application pour l’imagerie en temps réel des systèmes vivants^5. Une autre limite majeure de ces essais est le manque d’informations spatiales. D’autre part, les colorants lipophiles tels que Oil Red O et Sudan Black fournissent une distribution tissulaire et cellulaire des organites de stockage des lipides et par rapport aux techniques de SEP, ces méthodes de coloration sont également peu coûteuses et faciles à réaliser. Cependant, ces protocoles de coloration nécessitent une fixation, ce qui peut avoir un impact sur la nature hydrophobe des gouttelettes lipidiques, générer des changements artificiels dans leur structure et entraîner des incohérences entre les expériences^6. Les difficultés techniques liées aux techniques biochimiques et de coloration ont mené à la recherche de méthodes sans étiquette pour imager des molécules lipidiques et à l’augmentation rapide de l’utilisation de la microscopie cohérente de diffusion de Raman (CRS) dans l’imagerie lipidique.

L’effet Raman a d’abord été reconnu par Raman et Krishnan, où ils ont rapporté qu’en interagissant avec un photon, une molécule peut générer de la lumière diffusée sans changement de longueur d’onde (appelée diffusion de Rayleigh) ou rarement avec une longueur d’onde altérée (appelée diffusion Raman) et ce changement de longueur d’onde est caractéristique des groupes chimiques fonctionnels au sein de la molécule^7. Lorsque les liaisons chimiques au sein d’une molécule sont excitées à un niveau d’énergie vibratoire plus élevé par un photon incident, appelé photon de pompe, l’énergie du photon dispersé, appelé photon de Stokes, devient plus faible. Sinon, les liaisons chimiques peuvent atteindre un niveau d’énergie vibratoire inférieur si elles sont à l’origine à un niveau supérieur, et le photon dispersé gagne de l’énergie pour être le photon anti-Stokes. La différence de fréquence entre l’incident et les photons dispersés est connue sous le nom de décalage Raman. Chaque liaison chimique au sein d’une molécule a un décalage Raman caractéristique et quantifiable. Par exemple, la liaison_CH2 présente un décalage Raman de 2 845^cm-1,ce qui est abondant dans les chaînes d’acides gras^8. Ce signal raman spontané est généralement très faible, ce qui a considérablement limité la vitesse d’imagerie en microscopie raman spontanée conventionnelle. Au fil des ans, diverses approches ont été développées pour augmenter la vitesse d’imagerie et la sensibilité de la microscopie Raman spontanée. La microscopie à diffusion Raman cohérente, y compris la microscopie à diffusion Raman anti-Stokes cohérente (CARS) et la microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS), est le progrès le plus récent. Cars et SRS ont des principes de travail légèrement différents, mais les deux sont des techniques sans étiquette qui ont une capacité d’imagerie en direct, peuvent fournir des informations spatiales et temporelles sur la dynamique de stockage des lipides, et ne nécessitent qu’une petite taille d’échantillon. La microscopie CARS souffre d’un fond non résonnant, qui provient de divers processus non linéaires, et les signaux CARS ont également une relation non linéaire avec la concentration de la molécule, ce qui complique ensemble le processus de quantification^9. Contrairement à la microscopie CARS, la microscopie SRS ne génère pas de signaux de fond non résonnants et offre une dépendance linéaire à la concentration de la molécule d’intérêt. Ainsi, actuellement la microscopie SRS est plus largement utilisée pour l’imagerie lipidique.

En microscopie SRS, les signaux Raman spontanés faibles peuvent être amplifiés lorsqu’ils sont excités par deux faisceaux laser synchronisés avec leur différence de fréquence correspondant à la fréquence vibratoire de liaison chimique. La molécule connaîtra une transition améliorée vers un état excité grâce à une excitation cohérente. En conséquence, le taux de génération de photons de Stokes est augmenté. Par conséquent, l’intensité du faisceau « Stokes » transmis augmente (gain Raman stimulé, SRG) et l’intensité du faisceau « pompe » transmis diminue (perte Raman stimulée, SRL). La détection de signaux SRG ou SRL sous-tend la base de l’imagerie par microscopie à diffusion raman stimulée (SRS) de molécules avec des liaisons chimiques spécifiques^10. Si la différence de fréquence entre les deux faisceaux laser ne correspond pas à la fréquence vibratoire de la liaison chimique au sein d’une molécule d’intérêt, ni les signaux SRG ni SRL ne seront générés. La vitesse d’imagerie de la microscopie SRS est d’environ 2 μsec par pixel ou 1 seconde par image, ce qui est beaucoup plus rapide que la microscopie Raman spontanée^11. La résolution latérale typique pour la microscopie SRS est limitée par diffraction et autour de 300 nm. En outre, les processus optiques à deux photons de la microscopie SRS permettent l’imagerie 3D volumétrique d’échantillons de tissus relativement épais et la profondeur d’imagerie pourrait atteindre 300 à 500 μm. Dans l’ensemble, la microscopie SRS présente une technique d’imagerie efficace et sans étiquette pour détecter des biomolécules spécifiques, en particulier les lipides.

Les gouttelettes lipidiques sont des organites à membrane unique, qui sont le principal site de stockage cellulaire pour les lipides neutres, y compris les triacylglycérols (TAGs) et les esters de cholestérol (CE). Les liaisons_CH2 dans les chaînes d’acides gras de ces molécules lipidiques génèrent des signaux SRS forts à 2 845^cm-1 lorsqu’elles sont excitées^8,permettant ainsi la détection et la quantification des taux de lipides de stockage dans des cellules intactes, des sections tissulaires et même des organismes entiers 12,13,14,15. En particulier, C. elegans sont utiles pour les études d’imagerie lipidique en raison de leur transparence. Comme les mammifères, C. elegans stocke également les lipides dans les gouttelettes lipidiques et les voies de synthèse et de dégradation des molécules lipidiques sont hautement conservées^16. Dans ce protocole, nous fournirons le principe de fonctionnement de la microscopie SRS, sa configuration fondamentale et décrirons les méthodes pour son utilisation dans l’imagerie lipidique chez C. elegans.

Protocol

1. Configuration instrumentale pour la microscopie à diffusion Raman stimulée REMARQUE: Le système de microscopie SRS est construit sur un laser picoseconde avec oscillateur paramétrique optique intégré à la pompe et un microscope à balayage laser confocal. L’oscillateur fournit deux trains d’impulsions picosecondes, dont un faisceau de Stokes à 1 064 nm et un faisceau de pompe accordable entre 700 et 990 nm. Le chevauchement temporel et spatial des deux faisceaux est réalisé à l…

Representative Results

La signalisation de l’insuline est une voie endocrinienne importante qui affecte le développement, la reproduction, la durée de vie et le métabolisme. Chez les vers, la signalisation de l’insuline se compose d’environ 40 ligands peptidiques analogues à l’insuline, d’un orthologue de récepteur du facteur de croissance analogue à l’insuline DAF-2, d’une cascade de kinase PI3K /AKT en aval et de l’orthologue du facteur de transcription FoxO, DAF-1620. les mutants daf-2,…

Discussion

Pour se défendre contre l’obésité et ses troubles métaboliques associés, d’importants efforts de recherche ont été mis en œuvre pour mieux comprendre les mécanismes de régulation de l’homéostasie lipidique. Pour la détection quantitative des molécules lipidiques dans les échantillons biologiques, l’imagerie sans étiquette par microscopie SRS s’est avérée être une alternative fiable aux tests biochimiques et à d’autres méthodes de coloration. Notre groupe et d’autres ont révélé de nouv…

Materials

A/D converter	Olympus	Analog Unit
Agarose	GeneMate	3119	For making agarose pads
Alignment tool – adapter	Thorlabs	SM1A4	For mounting the tool on scope
Alignment tool – target	Thorlabs	VRC2SM1	For viewing IR laser
Alignment tool – tube	Thorlabs	SM1L40	Length can vary
Autocorrelator (Optional)	APE	pulseCheck
Bandpass filter	minicircuits	BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz	For signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscope	Nikon	SMZ800	For handling and picking worms for imaging
Dodecane	Sigma-Aldrich	44010	Used for calibration of the SRS signal
Filter	Chroma Technology	890/220 CARS	For removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tape	VWR	89097	For making agarose pads
Glass coverslips	VWR	48393-106	For covering worms for imaging
Glass microscope slide	VWR	16004-422	For making agarose pads
Laser scanning microscope	Olympus	FV3000
Lens	Thorlabs	L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B	For beam expander
Lock-in amplifier	Zurich	HF2LI
Lowpass filter	minicircuits	BLP-1.9+	For power supply noise suppression
Mirrors	Thorlabs	BB1-E03	For relay and periscope
Objective	Olympus	UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
Photodiode	Thorlabs	FDS1010
Picosecond laser source	APE	picoEmerald
Power supply	TEKPOWER	TP1342U	For photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azide	Sigma	S2002	For anaesthesizing the worms
Worm picker	WormStuff	59-AWP