Knochenmarktransplantationsverfahren bei Mäusen zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese
Summary
Wir beschreiben drei Methoden der Knochenmarktransplantation (BMT): BMT mit Ganzkörperbestrahlung, BMT mit abgeschirmter Bestrahlung und BMT-Methode ohne Vorkonditionierung (adoptive BMT) zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese in Mausmodellen.
Abstract
Die klonale Hämatopoese ist eine weit verbreitete altersbedingte Erkrankung, die sich aus der Anhäufung somatischer Mutationen in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) ergibt. Mutationen in Treibergenen, die zelluläre Fitness verleihen, können zur Entwicklung expandierender HSPC-Klone führen, die zunehmend zu Nachkommenleukozyten führen, die die somatische Mutation beherbergen. Da klonale Hämatopoese mit Herzerkrankungen, Schlaganfall und Mortalität in Verbindung gebracht wurde, ist die Entwicklung experimenteller Systeme, die diese Prozesse modellieren, der Schlüssel zum Verständnis der Mechanismen, die diesem neuen Risikofaktor zugrunde liegen. Knochenmarktransplantationsverfahren mit myeloablativer Konditionierung bei Mäusen, wie z. B. Ganzkörperbestrahlung (TBI), werden häufig eingesetzt, um die Rolle von Immunzellen bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu untersuchen. Eine gleichzeitige Schädigung der Knochenmarknische und anderer interessensvoller Stellen wie Herz und Gehirn ist bei diesen Verfahren jedoch unvermeidbar. Daher hat unser Labor zwei alternative Methoden entwickelt, um mögliche Nebenwirkungen durch TBI zu minimieren oder zu vermeiden: 1) Knochenmarktransplantation mit Bestrahlungsabschirmung und 2) adoptive BMT bei nicht konditionierten Mäusen. In abgeschirmten Organen bleibt die lokale Umgebung erhalten, was die Analyse der klonalen Hämatopoese ermöglicht, während die Funktion der ansässigen Immunzellen ungestört ist. Im Gegensatz dazu hat die adoptive BMT bei nicht konditionierten Mäusen den zusätzlichen Vorteil, dass sowohl die lokale Umgebung der Organe als auch die hämatopoetische Nische erhalten bleiben. Hier vergleichen wir drei verschiedene hämatopoetische Zellrekonstitutionsansätze und diskutieren ihre Stärken und Grenzen für Studien zur klonalen Hämatopoese bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen.
Introduction
Klonale Hämatopoese (CH) ist eine Erkrankung, die häufig bei älteren Menschen beobachtet wird und als Folge eines erweiterten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellklons (HSPC) auftritt, der eine genetische Mutation trägt1. Es wurde vermutet, dass die meisten Individuen im Alter von 50 Jahren durchschnittlich fünf exonische Mutationen in jedem HSPC2erworben haben, aber die meisten dieser Mutationen werden zu wenig oder keinen phänotypischen Folgen für das Individuum führen. Wenn jedoch zufällig eine dieser Mutationen dem HSPC einen Wettbewerbsvorteil verschafft – z. B. durch die Förderung seiner Proliferation, Selbsterneuerung, Überleben oder einer Kombination davon – kann dies zu einer bevorzugten Expansion des mutierten Klons im Vergleich zu den anderen HSPCs führen. Infolgedessen wird sich die Mutation zunehmend durch das hämatopoetische System ausbreiten, da das mutierte HSPC zu reifen Blutzellen führt, was zu einer ausgeprägten Population mutierter Zellen im peripheren Blut führt. Während Mutationen in Dutzenden verschiedener Kandidatentreibergene mit klonalen Ereignissen innerhalb des hämatopoetischen Systems in Verbindung gebracht wurden, sind unter diesen Mutationen in DNA-Methyltransferase 3 alpha (DNMT3A) und zehn elf Translokation 2 (TET2) am häufigsten3. Mehrere epidemiologische Studien haben ergeben, dass Personen, die diese genetischen Mutationen tragen, ein signifikant höheres Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD), Schlaganfall und gesamtverursachende Mortalität haben3,4,5,6,7. Während diese Studien festgestellt haben, dass ein Zusammenhang zwischen CH und erhöhter Inzidenz von CVD und Schlaganfall besteht, wissen wir nicht, ob dieser Zusammenhang kausal oder ein gemeinsames Epiphänomen mit dem Alterungsprozess ist. Um diesen Zusammenhang besser zu verstehen, sind geeignete Tiermodelle erforderlich, die den menschlichen Zustand von CH korrekt rekapitulieren.
Mehrere CH-Tiermodelle wurden von unserer Gruppe und anderen mit Zebrafischen, Mäusen und nicht-menschlichen Primaten8,9,10,11,12,13,14erstellt. Diese Modelle verwenden häufig hämatopoetische Rekonstitutionsmethoden durch Transplantation genetisch veränderter Zellen, manchmal unter Verwendung der Cre-lox-Rekombination oder des CRISPR-Systems. Dieser Ansatz ermöglicht die Analyse einer spezifischen Genmutation in hämatopoetischen Zellen, um zu beurteilen, wie sie zur Krankheitsentwicklung beiträgt. Darüber hinaus verwenden diese Modelle oft kongenische oder Reporterzellen, um die Wirkungen mutierter Zellen von normalen oder Wildtypzellen zu unterscheiden. In vielen Fällen ist ein Vorkonditionierungsschema erforderlich, um hämatopoetische Spenderstammzellen erfolgreich zu transplantieren.
Derzeit kann die Transplantation von Knochenmark auf Empfängermäuse in zwei Hauptkategorien unterteilt werden: 1) myeloablative Konditionierung und 2) nicht konditionierte Transplantation. Die myeloablative Konditionierung kann durch eine von zwei Methoden erreicht werden, nämlich Die Ganzkörperbestrahlung (TBI) oder die Chemotherapie15. TBI wird durchgeführt, indem der Empfänger einer tödlichen Dosis Gamma- oder Röntgenbestrahlung unterzogen wird, wodurch DNA-Brüche oder Querverbindungen innerhalb sich schnell teilender Zellen erzeugt werden, wodurch sie irreparabel werden16. Busulfan und Cyclophosphamid sind zwei häufig verwendete Chemotherapeutika, die die hämatopoetische Nische stören und in ähnlicher Weise DNA-Schäden an sich schnell teilenden Zellen verursachen. Das Nettoergebnis der myeloablativen Vorkonditionierung ist die Apoptose hämatopoetischer Zellen, die das hämatopoetische System des Empfängers zerstört. Diese Strategie ermöglicht nicht nur die erfolgreiche Transplantation der Spender-HSPCs, sondern kann auch eine Transplantatabstoßung verhindern, indem das Immunsystem des Empfängers unterdrückt wird. Die myeloablative Vorkonditionierung hat jedoch schwere Nebenwirkungen wie Schäden an Geweben und Organen und deren ansässigen Immunzellen sowie Die Zerstörung der nativen Knochenmarknische17. Daher wurden alternative Methoden vorgeschlagen, um diese unerwünschten Nebenwirkungen zu überwinden, insbesondere im Hinblick auf Schäden an den interessierender Organen. Diese Methoden umfassen die abgeschirmte Bestrahlung von Empfängermäusen und die adoptive BMT auf nicht konditionierte Mäuse9,17. Die Abschirmung des Thorax, der Bauchhöhle, des Kopfes oder anderer Regionen vor Bestrahlung durch die Platzierung einer Bleibarriere schützt das interessierende Gewebe vor den schädlichen Auswirkungen der Bestrahlung und erhält seine ansässige Immunzellpopulation. Auf der anderen Seite hat die adoptive BMT von HSPCs für nicht konditionierte Mäuse einen zusätzlichen Vorteil, da sie die native hämatopoetische Nische bewahrt. In diesem Manuskript beschreiben wir die Protokolle und Ergebnisse der HSPC-Transplantation nach mehreren Transplantationsschemata bei Mäusen, insbesondere die Abgabe von HSPC an TBI-Mäuse, an Mäuse, die teilweise vor Bestrahlung geschützt sind, und an nicht konditionierte Mäuse. Das übergeordnete Ziel ist es, den Forschern zu helfen, die verschiedenen physiologischen Auswirkungen jeder Methode zu verstehen und zu verstehen, wie sie die experimentellen Ergebnisse im Rahmen von CH und Herz-Kreislauf-Erkrankungen beeinflussen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für Studien der klonalen Hämatopoese beschrieben wir drei Methoden der BMT: BMT mit Ganzkörperbestrahlung, BMT mit Bestrahlung mit partieller Abschirmung und eine weniger häufig verwendete BMT-Methode, die keine Vorkonditionierung beinhaltet (adoptive BMT). Diese Methoden wurden verwendet, um die Auswirkungen der klonalen Hämatopoese auf Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu bewerten. Forscher können diese Methoden entsprechend dem spezifischen Zweck ihrer Studie modifizieren.
Klonale H…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der US National Institutes of Health an K. Walsh (HL131006, HL138014 und HL132564), an S. Sano (HL152174), american Heart Association grant an M. A. Evans (20POST35210098) und ein Japan Heart Foundation Grant an H. Ogawa unterstützt.
Materials
| 0.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-121 | general supply |
| 1.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-129 | general supply |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | general supply |
| BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle | Becton Dickinson | 309626 | general supply |
| BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | general supply |
| Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | equipment |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | general supply |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | general supply |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Ketamine | Zoetis | 043-304 | injection |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | KCC34155 | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | injection |
| Xylazine | Akorn | 139-236 | injection |
| X-ray irradiator | Rad source | RS-2000 | equipment |
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