تصنيع صفائف الأنسجة الدقيقة القلبية 3D باستخدام الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC البشرية ، والخلايا الليفية القلبية ، والخلايا البطانية
Summary
هنا ، نصف منهجية سهلة الاستخدام لإنشاء صفائف الأنسجة الدقيقة القلبية ذاتية التجميع 3D التي تتكون من الخلايا العضلية القلبية متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المتمايزة مسبقا ، والخلايا الليفية القلبية ، والخلايا البطانية. يمكن تنفيذ هذه التقنية سهلة الاستخدام ومنخفضة الخلايا التي تتطلب تقنية لتوليد الأنسجة الدقيقة القلبية لنمذجة الأمراض والمراحل المبكرة من تطوير الدواء.
Abstract
وقد وفر توليد الخلايا العضلية القلبية البشرية (CMs) والخلايا الليفية القلبية (CFs) والخلايا البطانية (ECs) من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) فرصة فريدة لدراسة التفاعل المعقد بين أنواع الخلايا القلبية الوعائية المختلفة التي تدفع نمو الأنسجة والمرض. في مجال نماذج الأنسجة القلبية ، تستخدم العديد من الأساليب ثلاثية الأبعاد المتطورة (3D) الخلايا العضلية القلبية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية (iPSC-CMs) لمحاكاة الأهمية الفسيولوجية وبيئة الأنسجة الأصلية مع مزيج من المصفوفات خارج الخلية والروابط المتقاطعة. ومع ذلك ، فإن هذه الأنظمة معقدة للتصنيع دون خبرة في التصنيع الدقيق وتتطلب عدة أسابيع للتجميع الذاتي. الأهم من ذلك ، أن العديد من هذه الأنظمة تفتقر إلى الخلايا الوعائية والخلايا الليفية القلبية التي تشكل أكثر من 60٪ من الخلايا غير العضلية في قلب الإنسان. هنا نصف اشتقاق جميع أنواع خلايا القلب الثلاثة من iPSCs لتصنيع الأنسجة الدقيقة القلبية. تسمح تقنية التشكيل المتماثل سهلة هذه بزراعة الأنسجة الدقيقة القلبية في لوحات زراعة الخلايا القياسية متعددة الآبار لعدة أسابيع. تسمح المنصة بالتحكم المحدد من قبل المستخدم في أحجام الأنسجة الدقيقة بناء على كثافة البذر الأولية وتتطلب أقل من 3 أيام للتجميع الذاتي لتحقيق تقلصات الأنسجة الدقيقة القلبية التي يمكن ملاحظتها. علاوة على ذلك ، يمكن هضم الأنسجة الدقيقة القلبية بسهولة مع الحفاظ على صلاحية عالية للخلية للاستجواب أحادي الخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq). نحن نتصور أن هذا النموذج المختبري للأنسجة الدقيقة القلبية سيساعد على تسريع دراسات التحقق من الصحة في اكتشاف الأدوية ونمذجة الأمراض.
Introduction
يواجه اكتشاف الأدوية ونمذجة الأمراض في مجال أبحاث القلب والأوعية الدموية العديد من التحديات بسبب نقص العينات ذات الصلة سريريا وعدم كفاية الأدوات الانتقالية1. لا تظهر النماذج ما قبل السريرية شديدة التعقيد أو النماذج أحادية الخلية المبسطة في المختبر ظروفا فسيولوجية مرضية بطريقة قابلة للتكرار. لذلك ، تطورت العديد من المنصات المصغرة التي تم هندستها بالأنسجة للمساعدة في سد الفجوة ، بهدف تحقيق توازن بين سهولة التطبيق بطريقة عالية الإنتاجية والتلخيص الأمين لوظيفة الأنسجة 2,3. مع ظهور تكنولوجيا الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) ، يمكن تطبيق أدوات هندسة الأنسجة على الخلايا الخاصة بالمريض مع أو بدون حالة أمراض القلب والأوعية الدموية الكامنة للإجابة على أسئلة البحث4،5،6. يمكن استخدام مثل هذه النماذج الهندسية للأنسجة ذات التركيب الخلوي المشابه لأنسجة القلب في جهود تطوير الأدوية لاختبار سمية القلب والخلل الوظيفي الناجم عن التغيرات المرضية في سلوك نوع واحد أو عدة خلايا.
الأنسجة الدقيقة ذاتية التجميع أو الأعضاء المشتقة من iPSCs البشرية هي هياكل ثلاثية الأبعاد (3D) عبارة عن تجمعات مصغرة تشبه الأنسجة تظهر أوجه تشابه وظيفية مع نظيراتها في الجسم الحي. هناك العديد من الأساليب المختلفة التي تسمح بتكوين المواد العضوية في الموقع عن طريق التمايز الموجه ل iPSCs أو من خلال تكوين الأجسام الجنينية4. المواد العضوية الناتجة هي أداة لا غنى عنها لدراسة العمليات المورفوجينية التي تدفع التكوين العضوي. ومع ذلك، فإن وجود مجموعة متنوعة من مجموعات الخلايا والاختلافات في التنظيم الذاتي يمكن أن يؤدي إلى تباين في النتائج بين المواد العضوية المختلفة5. بدلا من ذلك ، تعد الخلايا المتمايزة مسبقا التي يتم تجميعها ذاتيا في أنسجة دقيقة ذات أنواع خلايا خاصة بالأنسجة لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية المحلية نماذج ممتازة ، حيث يكون من الممكن عزل المكونات المجمعة ذاتيا. خاصة في أبحاث القلب البشري ، أثبت تطوير الأنسجة الدقيقة القلبية 3D ذات المكونات متعددة الخلايا أنه يمثل تحديا عندما يتم اشتقاق الخلايا من خطوط مختلفة للمرضى أو مصادر تجارية.
لتحسين فهمنا الميكانيكي لسلوكيات الخلايا في نموذج ذو صلة فسيولوجية وشخصية ومختبرية ، من الناحية المثالية ، يجب اشتقاق جميع أنواع الخلايا المكونة من نفس خط المريض. في سياق القلب البشري ، فإن نموذج القلب التمثيلي الحقيقي في المختبر من شأنه أن يلتقط الحديث المتبادل بين أنواع الخلايا السائدة ، وهي الخلايا العضلية القلبية (CMs) ، والخلايا البطانية (ECs) ، والخلايا الليفية القلبية (CFs) 6,7. لا يتطلب التلخيص الأمين لعضلة القلب التمدد الفيزيائي الحيوي والتحفيز الكهروفسيولوجي فحسب ، بل يتطلب أيضا إشارات الخلايا الخلوية التي تنشأ عن أنواع الخلايا الداعمة مثل ECs و CFs8. تشارك CFs في تخليق المصفوفة خارج الخلية والحفاظ على بنية الأنسجة. وفي حالة مرضية ، يمكن أن تحفز CFs التليف وتغير التوصيل الكهربائي في CMs9. وبالمثل ، يمكن لل ECs تنظيم الخصائص الانقباضية ل CMs من خلال إشارات paracrine وتوفير متطلبات التمثيل الغذائي الحيوية 10. وبالتالي ، هناك حاجة إلى أنسجة القلب الدقيقة البشرية المكونة من جميع أنواع الخلايا الرئيسية الثلاثة للسماح بإجراء تجارب عالية الإنتاجية ذات صلة فسيولوجية.
هنا ، نصف نهجا من أسفل إلى أعلى في تصنيع الأنسجة الدقيقة القلبية عن طريق اشتقاق الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC البشرية (iPSC-CMs) ، والخلايا البطانية المشتقة من iPSC (iPSC-ECs) ، والخلايا الليفية القلبية المشتقة من iPSC (iPSC-CFs) وثقافتها 3D في صفائف الأنسجة الدقيقة القلبية الموحدة. يمكن استخدام هذه الطريقة السهلة لتوليد الأنسجة الدقيقة القلبية التي تنبض تلقائيا لنمذجة الأمراض والاختبار السريع للأدوية من أجل الفهم الوظيفي والميكانيكي لفسيولوجيا القلب. علاوة على ذلك ، يمكن استغلال منصات الأنسجة الدقيقة القلبية متعددة الخلايا هذه بتقنيات تحرير الجينوم لمحاكاة تطور أمراض القلب بمرور الوقت في ظل ظروف الثقافة المزمنة أو الحادة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لتوليد أنسجة دقيقة للقلب من iPSC-CMs و iPSC-ECs و iPSC-CFs المتمايزة مسبقا ، من الضروري الحصول على ثقافة نقية للغاية للتحكم بشكل أفضل في أعداد الخلايا بعد ضغط الخلايا المثبط للاتصال داخل الأنسجة الدقيقة القلبية. في الآونة الأخيرة ، جياكوميلي وآخرون. وقد أثبتت al.18 تصنيع الأنسجة الدقيقة ال…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتورة أماندا تشيس على ملاحظاتها المفيدة على المخطوطة. وقدم الدعم التمويلي برنامج بحوث الأمراض المتصلة بالتبغ التابع لجامعة كاليفورنيا، T29FT0380 (D.T) و 27IR-0012 (J.C.W.)؛ جمعية القلب الأمريكية 20POST35210896 (H.K.) و 17MERIT33610009 (J.C.W.) ؛ والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01 HL126527 و R01 HL123968 و R01 HL150693 و R01 HL141851 و NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
Materials
| 12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
| B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
| CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
| CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
| Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
| Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
| DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
| DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
| Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
| Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
| LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
| MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
| RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
| TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
| TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
| Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |
Riferimenti
- Neofytou, E., O’Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166 (2018).
- Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
- Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
- Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
- Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
- Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
- Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
- Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
- Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , 1-7 (2020).
- Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
- Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
- Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
- Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
- Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
- Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).
- Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
- Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
- Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
- McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
- Thomas, D., O’Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).
- Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39 (2021).
- Rhee, J. -. W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).
- Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
- Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
- Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
- Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).
