Her beskriver vi en brukervennlig metodikk for å generere 3D-selvmonterte hjertemikrotissuekjeder sammensatt av pre-differensierte menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller. Denne brukervennlige og lave cellen som krever teknikk for å generere hjertemikroser kan implementeres for sykdomsmodellering og tidlige stadier av narkotikautvikling.
Generering av humane kardiomyocytter (CMs), hjertefibroblaster (CFer) og endotelceller (ECs) fra induserte pluripotente stamceller (iPSCer) har gitt en unik mulighet til å studere det komplekse samspillet mellom forskjellige kardiovaskulære celletyper som driver vevsutvikling og sykdom. Innen hjertevevsmodeller bruker flere sofistikerte tredimensjonale (3D) tilnærminger indusert pluripotent stamcelleavledede kardiomyocytter (iPSC-CMs) for å etterligne fysiologisk relevans og innfødt vevsmiljø med en kombinasjon av ekstracellulære matriser og krysskoblinger. Imidlertid er disse systemene komplekse å fremstille uten mikrofabrikasjonskompetanse og krever flere uker å montere seg selv. Viktigst av alt mangler mange av disse systemene vaskulære celler og hjertefibroblaster som utgjør over 60% av de ikke-fyocyttene i menneskehjertet. Her beskriver vi avledningen av alle tre hjertecelletyper fra iPSC til fabrikat hjertemikrotissues. Denne facile kopi molding teknikken tillater hjerte mikrotissue kultur i standard multi-brønn celle kultur plater i flere uker. Plattformen tillater brukerdefinert kontroll over mikrotissestørrelser basert på innledende såddtetthet og krever mindre enn 3 dager for selvmontering for å oppnå observerbare hjertemikrotissuekontraksjoner. Videre kan hjertemikrotissuene lett fordøyes samtidig som høy celle levedyktighet for encellet forhør med bruk av strømningscytometri og encellet RNA-sekvensering (scRNA-seq). Vi ser for oss at denne in vitro-modellen av hjertemikroter vil bidra til å akselerere valideringsstudier i legemiddeloppdagelse og sykdomsmodellering.
Legemiddeloppdagelse og sykdomsmodellering innen kardiovaskulær forskning står overfor flere utfordringer på grunn av mangel på klinisk relevante prøver og utilstrekkelige translasjonsverktøy1. Svært komplekse prekliniske modeller eller forenklede in vitro encellede modeller viser ikke patofysiologiske forhold på en reproduserbar måte. Derfor har flere miniatyriserte vevskonstruerte plattformer utviklet seg for å bidra til å bygge bro over gapet, med mål om å oppnå en balanse mellom brukervennlighet på en høy gjennomstrømningsmåte og trofast recapitulation av vevsfunksjon2,3. Med ankomsten av indusert pluripotent stamcelle (iPSC) teknologi, vev engineering verktøy kan brukes på pasientspesifikke celler med eller uten underliggende kardiovaskulær sykdom tilstand for å svare på forskningsspørsmål4,5,6. Slike vevskonstruerte modeller med cellulær sammensetning som ligner hjertevevet, kan brukes i narkotikautviklingsarbeidet for å teste for kardiotoksisitet og dysfunksjon forårsaket av patologiske endringer i oppførselen til en eller flere celletyper.
Selvmonterte mikrotissuer eller organoider avledet fra menneskelige iPSCer er tredimensjonale (3D) strukturer som er miniatyrvevlignende forsamlinger som viser funksjonelle likheter med sine in vivo-kolleger . Det finnes flere forskjellige tilnærminger som tillater dannelse av organoider in situ via rettet differensiering av iPSC eller gjennom dannelsen av embryoide legemer4. De resulterende organoidene er et uunnværlig verktøy for å studere morfogenetiske prosesser som driver organogenese. Tilstedeværelsen av en rekke cellepopulasjoner og forskjeller i selvorganisering kan imidlertid føre til variasjon i resultatene mellom forskjellige organoider5. Alternativt er forhåndsdifferensierte celler som er selvmontert i mikrobehov med vevsspesifikke celletyper for å studere lokale cellecelleinteraksjoner gode modeller, der det er mulig å isolere de selvmonterte komponentene. Spesielt i menneskelig hjerteforskning har utvikling av 3D-hjertemikrobehov med multicellulære komponenter vist seg å være utfordrende når celler er avledet fra forskjellige pasientlinjer eller kommersielle kilder.
For å forbedre vår mekanistiske forståelse av celleatferd i en fysiologisk relevant, personlig, in vitro-modell, bør ideelt sett alle komponentcelletyper avledes fra samme pasientlinje. I sammenheng med et menneskehjerte ville en virkelig representativ hjerteintromodell fange krysstale blant dominerende celletyper, nemlig kardiomyocytter (CMs), endotelceller (ECs) og hjertefibroblaster (CFs) 6,7. Den trofaste recapitulation av et myokardi krever ikke bare biofysisk strekk og elektrofysiologisk stimulering, men også cellecellesignalering som oppstår fra støttende celletyper som ECs og CFs8. CFer er involvert i syntesen av ekstracellulær matrise og opprettholde vevsstruktur; og i en patologisk tilstand kan CFer indusere fibrose og endre elektrisk ledning i CMs9. På samme måte kan ECer regulere kontraktilegenskaper til CMs gjennom parakrinesignalering og levering av vitale metabolske krav10. Derfor er det behov for menneskelige hjertemikrobehov som består av alle de tre hovedcelletypene for å tillate fysiologisk relevante høygjennomstrømningseksperimenter.
Her beskriver vi en nedenfra-og-opp-tilnærming i fabrikasjon av hjertemikroter ved avledning av humane iPSC-avledede kardiomyocytter (iPSC-CMs), iPSC-avledede endotelceller (iPSC-OKKER) og iPSC-avledede hjertefibroblaster (iPSC-CFer) og deres 3D-kultur i ensartede hjertemikrotissyndematriser. Denne facile metoden for å generere spontant slå hjertemikrotissues kan brukes til sykdomsmodellering og rask testing av legemidler for funksjonell og mekanistisk forståelse av hjertefysiologi. Videre kan slike multicellulære hjertemikrotissueplattformer utnyttes med genomredigeringsteknikker for å etterligne hjertesykdomsprogresjon over tid under kroniske eller akutte kulturforhold.
For å generere hjertemikrobrikker fra forhåndsdifferensierte iPSC-CMer, iPSC-OKKER og iPSC-CFer, er det viktig å få en svært ren kultur for bedre kontroll av cellenumre etter kontakthemmet cellekomprimering i hjertemikrotissuene. Nylig, Giacomelli et. al.18 har demonstrert fabrikasjonen av hjertemikroter ved hjelp av iPSC-CMer, iPSC-OKKER og iPSC-CFer. Hjertemikroser som genereres ved hjelp av den beskrevne metoden, består av ~5000 celler (70 % iPSC-CMer, 15 % iPSC-ECer og 15 % iPSC-CFer). I…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Amanda Chase for hennes nyttige tilbakemelding på manuskriptet. Finansieringsstøtte ble gitt av Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) ved University of California, T29FT0380 (D.T.) og 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) og 17MERIT33610009 (J.C.W.); og National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 og NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |