Etikettfritt kvantitativt proteomiskt arbetsflöde för identifieringsdrivna värdpatogeninteraktioner
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att profilera samspelet mellan värd och patogen under infektion genom masspektrometribaserad proteomik. Detta protokoll använder etikettfri kvantifiering för att mäta förändringar i proteinförekomsten hos både värd (t.ex. makrofager) och patogen (t.ex. Cryptococcus neoformans) i ett enda experiment.
Abstract
De tekniska resultaten av masspektrometri (MS)-baserade kvantitativa proteomik öppnar många oupptäckta vägar för att analysera en organisms globala proteom under olika förhållanden. Denna kraftfulla strategi tillämpas på interaktioner av mikrobiella patogener med den önskade värden karakteriserar omfattande båda perspektiven mot infektion. Häri beskriver arbetsflödet etikettfri kvantifiering (LFQ) av infektomet cryptococcus neoformans, en svamp facultative intracellulär patogen som är orsaksmedlet för den dödliga sjukdomen cryptococcosis, i närvaro av odödliga makrofagceller. Protokollet beskriver de korrekta proteinberedningsteknikerna för både patogena och däggdjursceller inom ett enda experiment, vilket resulterar i lämplig peptidinlämning för vätskekromatografi (LC)-MS/MS-analys. LFQ: s höga genomströmning generiska natur möjliggör ett brett dynamiskt utbud av proteinidentifiering och kvantifiering, samt överförbarhet till alla värdpatogena infektionsinställningar, vilket upprätthåller extrem känslighet. Metoden är optimerad för att katalogisera omfattande, opartiska protein överflöd profiler av en patogen inom infektion-härma villkor. Specifikt ger den metod som demonstreras här viktig information om C. neoformans patogenes, såsom proteinproduktion som är nödvändig för virulens och identifierar kritiska värdproteiner som svarar på mikrobiell invasion.
Introduction
Prevalensen av invasiva svampinfektioner ökar kraftigt och är korrelerad med oacceptabelt hög dödlighet, oftast rapporterad hos individer med immunodeficient predispositioner1. Cryptococcus neoformans är en ökänd opportunistisk svamp patogen som kan intracellulära överlevnad inom värd makrofag celler. Otillräcklig svampdödande ingripande resulterar i svamp spridning och livshotande manifestationer av cryptococcal hjärnhinneinflammation och meningoencephalitis2,3. Den globala ökningen av immunkomprometterad status har krävt en parallell ökning av användningen av svampdödande medel, där många svamparter, inklusive C. neoformaner, alltmer har utvecklat resistensmot 4,5,6. Därför är det absolut nödvändigt att införa robust och effektiv teknik för att besvara viktiga biologiska frågor om värdförsvarsrespons och mikrobiell patogenes.
Den nya tidsåldern av tekniska framsteg inom masspektrometri (MS), inklusive generering av kraftfulla beräknings- och bioinformatiska rörledningar, utgör grunden för en integrativ vision för storskalig analys av värdpatogen forskning7,8. Konventionell patogenes-driven proteomisk analys profilerar ofta synen på infektion från antingen värd- eller patogenperspektivet, inklusive omfattande metoder som proteinkorrelationsprofilering, affinitetskromatografi i kombination med proteomik och interactomik9. Undersökningar av virulensen hos farliga patogener i ett värdsystem är av enorm klinisk betydelse; Tillämpningen av en analys med dubbla perspektiv i ett enda experiment ansågs dock tidigare ouppnåelig. Till exempel överväldigas patogenens perspektiv mot infektion ofta av mycket rikliga värdproteiner vilket resulterar i minskad känslighet för påvisande av låg rikliga svampproteiner7. Dessutom inbjuder den höga provkomplexiteten många mål att undersöka i ett enda experimentellt system och visar sig vara utmanande att klargöra verkningsmekanismer för ett specifikt patogenprotein.
Bottom-up proteomik är en populär MS-teknik som möjliggör hanterbar provberedning, där peptider genereras av sekvensspecifik enzymatisk matsmältning följt av vätskekromatografiseparation, identifiering och kvantifiering av MS10,11. Här presenterar vi en metod som visar en databeroende förvärvsstrategi som syftar till att uppnå en opartisk täckning av en infektionsbaserad proteom eller “infectome”. Specifikt sprider etikettfri kvantifiering (LFQ) beroendet av kemiska eller metaboliska etiketter för robust och korrekt identifiering av proteinnivåförändringar över flera proteomer, vilket minskar provhanteringen och bearbetningsstegen12,13. Denna universella tillämpning förhör producerade proteiner vid en given tidpunkt inom en cell oberoende av förväntad proteinproduktion. Således kan nya insikter upptäckas som är kritiska för infektion.
Arbetsflödet som beskrivs häri är optimerat för att utforska proteinnivåförändringar av C. neoformaner under infektions-härmande tillstånd med värd immunceller (Figur 1). I stället för att förlita sig på isolering och separation av celltyper extraherar detta tillvägagångssätt värden och patogenproteomen tillsammans och använder bioinformatisk separation med hjälp av två organismspecifika databaser för att skilja artspecifik proteinproduktion. Denna metod ger fördelar för ett obegränsat antal prover som ska bearbetas utan de extra kostsamma beredningssteg som krävs i isotopbaserade märkningsstudier eller fraktionering. Dessutom stöder detta arbetsflöde optimerade proteinutvinningsprotokoll som kan överföras till ett brett spektrum av svamp- och bakteriella patogener som kan rikta in sig på och infektera värd immunceller. Sammantaget beskriver detta protokoll stegen för att slutföra en opartisk proteinutvinning och provbehandling för högupplöst MS, följt av data och statistisk analys, som kan ge en mängd kunskap om svampproteiner som är viktiga för infektion i kombination med omfattande profilering av värdförsvarssvaret.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg i protokollet inkluderar beredning av makrofagceller och insamling av samkulturprover för proteinbearbetning med minimal störning i cellerna. Det är viktigt att utföra steg för tvättning, inokulera och ta bort vidhäftande makrofagceller försiktigt och noggrant för att förhindra onödig lys av celler före insamling. Att fastställa rätt MOI för experimentet är också avgörande eftersom inokulera med en alltför hög MOI kan orsaka snabb makrofagcelldöd och svårigheter att samla in och bearbe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Dr. Jonathan Krieger från Bioinformatics Solutions Inc. för att ha skött masspektrometern för representativa experiment, liksom medlemmar i Geddes-McAlister-gruppen för deras hjälp med experimentell uppsättning och manuskriptfeedback. Författarna erkänner delvis finansieringsstöd från Banting Research Foundation – The Jarislowsky Fellowship Discovery Award, New Frontiers Research Fund – Exploration (NFRFE-2019-00425) och Canadian Foundation for Innovation (JELF 38798) för J.G.M., samt NSERC Canada Graduate Scholarship – Masters and Ontario Graduate Scholarship for B.B., och Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology for A.S..
Materials
| 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 | Fisher Scientific | BP152-1 | Maintain at 4°C |
| 60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 174888 | |
| 6-well cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Acetonitrile, MS grade | Pierce | TS-51101 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1099510001 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850-1L | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | ThermoFisher Scientific | A643-500 | Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month. |
| Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System | Fisher Scientific | 13-717-300 | Not essential, serological pipettes can be used to remove media. |
| C18 resin | 3M Empore | 3M2215 | |
| Cell Scrapers | VWR | 10062-906 | Not essential, other methods to release macrophage cells can be used. |
| Centrifugal vaccuum concentrator | Eppendorf | 07-748-15 | |
| Complete Filtration Unit | VWR | 10040-436 | |
| Conical falcon tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Not essential, haemocytometer can be used as an alternative. |
| CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation |
| Haemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| High-performance liquid chromatography system | ThermoFisher Scientific | LC140 | Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples. |
| High-resolution mass spectrometer | ThermoFisher Scientific | 726042 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I6125 | Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| LoBind Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 13-698-794 | |
| MaxQuant | https://maxquant.org/ | MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 13864457 | |
| Penicillin : Streptomycin 10k/10k | VWR | CA12001-692 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| Peptide separation columns | ThermoFisher Scientific | ES803 | |
| Perseus Software | http://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phosphate Buffered Saline | VWR | CA12001-676 | Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use. |
| Pierce BCA Protein Assay | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pipette, Disposable Serological (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix | Fisher Scientific | 14955235 | |
| Probe sonciator | ThermoFisher Scientific | 100-132-894 | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ThermoFisher Scientific | 28364 | 20% (w/v) |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| STAGE tipping centrifuge | Sonation | STC-V2 | |
| Thermal Shaker | VWR | NO89232-908 | |
| Trifluoroacetic acid | ThermoFisher Scientific | 85183 | |
| Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade | Pierce | A40007 | Maintain at -20 °C. |
| Ultrasonic bath | Bransonic | A89375-450 | Stored in cold room (4C) |
| Urea | Sigma Aldrich | U1250-1KG | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| Yeast-extract peptone dextrose broth | BD Difco | BM20 |
Riferimenti
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. Journal of Fungi. , (2017).
- Tugume, L., et al. HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts. Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2017).
- Perfect, J. R. The antifungal pipeline: A reality check. Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).
- Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development. Journal of Fungi. , (2019).
- Sukumaran, A., et al. Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics. J Leukocyte Biol. , (2019).
- Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks. Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes. Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).
- Cox, J., et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics. Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. , (2011).
- Zhong, Z., Pirofski, L. A. Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies. Infection and Immunity. , (1996).
- Nicola, A. M., et al. Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans. Infection and Immunity. , (2012).
- Ball, B., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans. Current Protocols in Microbiology. , (2019).
- Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils. Current Protocols in Immunology. , (2019).
- Geddes, J. M. H., et al. Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A. BMC Microbiology. , (2015).
- Geddes, J. M. H., et al. Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation. mBio. 7 (1), 1-15 (2016).
- Al Shweiki, M. H. D. R., et al. Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance. Journal of Proteome Research. , (2017).
- Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Borner, G. H. H. Organellar Maps Through Proteomic Profiling – A Conceptual Guide. Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).
- Kugadas, A., et al. Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections. Journal of Leukocyte Biology. , (2019).
- Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface. Proteomics. , (2020).
- Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).
