خالية من التسمية تدفق عمل البروتوميات الكمية للتفاعلات المُضيفة-الممرضة مدفوعة بالإكتشاف
Summary
هنا، نقدم بروتوكولاً لتقديم لمحة عن التفاعل بين المضيف والممرض أثناء الإصابة بالبروتيوميات المستندة إلى الطيف الكتلي. يستخدم هذا البروتوكول تحديد كمي خال من التسمية لقياس التغيرات في وفرة البروتين لكل من المضيف (على سبيل المثال، الضامة) والعوامل الممرضة (مثل Cryptococcus neoformans)في تجربة واحدة.
Abstract
إن الإنجازات التكنولوجية لقياس الطيف الكتلي (MS) التي تعتمد على البروتيوم الكمي تفتح العديد من الطرق غير المكتشفة لتحليل البروتيوم العالمي للكائن الحي في ظل ظروف مختلفة. هذه الاستراتيجية القوية المطبقة على تفاعلات مسببات الأمراض الميكروبية مع المضيف المطلوب يميز بشكل شامل كلا المنظورين نحو العدوى. هنا، سير العمل يصف الكم خالية من التسمية (LFQ) من infectome من Cryptococcus الأشكال الجديدة، وهو مسبب أمراض داخل الخلايا الكلي الفطرية التي هي العامل المسبب ل cryptococcosis المرض القاتل، في وجود خلايا الضامة خلد. ويفصّل البروتوكول تقنيات إعداد البروتين المناسبة لكل من الخلايا المسببة للأمراض والثدييات في إطار تجربة واحدة، مما يؤدي إلى تقديم الببتيد المناسب لتحليل الكروماتوغرافيا السائلة (LC)-MS/MS. تسمح الطبيعة العامة العالية لـ LFQ بنطاق ديناميكي واسع من تحديد البروتين وتحديد كميته ، بالإضافة إلى قابلية النقل إلى أي إعداد للعدوى المضيفة – الممرض ، مع الحفاظ على حساسية شديدة. تم تحسين هذه الطريقة لفهرسة واسعة، غير متحيزة ملامح وفرة البروتين من الممرض داخل ظروف محاكاة العدوى. وعلى وجه التحديد، فإن الطريقة التي تم إظهارها هنا توفر معلومات أساسية عن التسبب في الأورام الجديدة، مثل إنتاج البروتين اللازم للوعاء وتحدد البروتينات المضيفة الحرجة التي تستجيب للغزو الميكروبي.
Introduction
انتشار الالتهابات الفطرية الغازية في تزايد كبير ويرتبط مع معدلات الوفيات العالية غير المقبولة، والأكثر شيوعا ذكرت في الأفراد الذين لديهم استعداد المناعي1. Cryptococcus النيوفورمات هو الممرض الفطري الانتهازية سيئة السمعة قادرة على البقاء على قيد الحياة داخل الخلايا داخل خلايا الضامة المضيفة. عدم كفاية نتائج التدخل المضاد للفطريات في نشر الفطريات ومظاهر تهدد الحياة من التهاب السحايا cryptococcal والتهاب السحايا2,3. وقد طالبت الزيادة العالمية في حالة المناعة زيادة موازية في استخدام العوامل المضادة للفطريات، التي العديد من الأنواع الفطرية، بما في ذلك C. النيوفورم، تطورت مقاومة متزايدة نحو4،5،6. ولذلك، لا بد من تنفيذ تكنولوجيات قوية وفعالة للإجابة على الأسئلة البيولوجية الحيوية المتعلقة باستجابة الدفاع المضيف والتنمّر الميكروبي.
العصر الجديد للتقدم التكنولوجي في القياس الطيفي الشامل (MS)، بما في ذلك توليد خطوط الأنابيب الحاسوبية الحيوية القوية، يوفر الأساس لرؤية تكاملية للتحليل على نطاق واسع من البحوث المضيفة المسببة للأمراض7،8. تحليل البروتيومي التقليدي الذي يحركه التسبب في التسبب في البروتيوم عادة ما يُحْسَر وجهة نظر العدوى من منظور المضيف أو الممرض، بما في ذلك منهجيات شاملة مثل التنميط الارتباط البروتيني، واللون اللوني المتقارب مع البروتيوميات،والتفاعلات 9. التحقيقات في ضراوة مسببات الأمراض الخطرة في نظام المضيف هي ذات أهمية سريرية هائلة; ومع ذلك، كان تطبيق تحليل منظور مزدوج في تجربة واحدة يعتبر سابقاً غير قابل للتحقيق. على سبيل المثال، غالباً ما تطغى على منظور الممرض نحو العدوى من قبل البروتينات المضيفة الوفيرة مما يؤدي إلى انخفاض الحساسية للكشف عن البروتينات الفطرية منخفضة وفيرة7. وعلاوة على ذلك، فإن تعقيد العينة العالية يدعو العديد من الأهداف للتحقيق في نظام تجريبي واحد وتثبت صعوبة في توضيح آليات العمل لبروتين مسبب للأمراض محددة.
البروتيوميات من أسفل إلى أعلى هو تقنية مرض التصلب العصبي المتعدد شعبية التي تمكن من إعداد العينة يمكن التحكم فيها، والتي يتم توليد الببتيدات عن طريق الهضم الأنزيمي تسلسل محددة تليها فصل الكروماتوغرافيا السائلة، وتحديد، والكمية من قبل MS10،11. هنا، نقدم طريقة توضح استراتيجية الاستحواذ المعتمدة على البيانات بهدف تحقيق تغطية غير متحيزة للبروتيوم القائم على العدوى أو “العدوى”. على وجه التحديد، الكم خالية من التسمية (LFQ) يلقي الاعتماد على التسميات الكيميائية أو الأيضية لتحديد قوية ودقيقة للتغيرات مستوى البروتين عبر البروتينات المتعددة، والحد من معالجة العينات ومعالجة الخطوات12،13. هذا التطبيق العالمي يستجوب البروتينات المنتجة في لحظة معينة داخل خلية مستقلة عن أي إنتاج البروتين المتوقع؛ وهكذا، يمكن اكتشاف رؤى جديدة التي تعتبر حاسمة للعدوى.
تم تحسين سير العمل الموضح هنا لاستكشاف التغيرات في مستوى البروتين من C. neoformans خلال حالات محاكاة العدوى مع الخلايا المناعية المضيفة (الشكل 1). وبدلاً من الاعتماد على عزل وفصل أنواع الخلايا، يستخرج هذا النهج البروتيم المضيف والمسبب للمرض معاً، ويستخدم الفصل المعلوماتي الحيوي باستخدام قاعدتي بيانات خاصتين بالكائنات الحية لتمييز إنتاج البروتينات الخاصة بالأنواع. وتوفر هذه الطريقة مزايا لعدد غير محدود من العينات التي يتعين معالجتها دون اتخاذ خطوات إعداد إضافية مكلفة ضرورية في دراسات وضع العلامات القائمة على النظائر أو الكسر. وعلاوة على ذلك، يدعم هذا العمل بروتوكولات استخراج البروتين المحسنة القابلة للنقل إلى مجموعة واسعة من مسببات الأمراض الفطرية والبكتيرية القادرة على استهداف الخلايا المناعية المضيفة وتصيبها. وعموما، يحدد هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لاستكمال استخراج البروتين غير متحيزة ومعالجة العينة ل MS عالية الدقة، تليها البيانات والتحليل الإحصائي، قادرة على توفير ثروة من المعرفة من البروتينات الفطرية الهامة للعدوى جنبا إلى جنب مع التنميط الشامل للاستجابة الدفاع المضيف.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول إعداد خلايا الضامة وجمع عينات من الثقافة المشتركة لمعالجة البروتين مع الحد الأدنى من التعطيل للخلايا. من المهم تنفيذ خطوات الغسيل والتطعيم وإزالة خلايا الضامة المتمسكة بلطف وعناية لمنع تحلل الخلايا غير الضرورية قبل جمعها. إنشاء وزارة الداخلية الصحيح …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور جوناثان كريغر من شركة حلول المعلوماتية الحيوية لتشغيله مطياف الكتلة للتجارب التمثيلية ، وكذلك أعضاء مجموعة Geddes-McAlister لمساعدتهم في الإعداد التجريبي والتغذية المرتدة للمخطوطة. يعترف المؤلفون بالدعم التمويلي، جزئياً، من مؤسسة بانتينغ للبحوث – جائزة اكتشاف الزمالة Jarislowsky, صندوق أبحاث الحدود الجديدة – استكشاف (NFRFE-2019-00425)، والمؤسسة الكندية للابتكار (JELF 38798) لJ.G.M.، فضلا عن منحة الدراسات العليا NSERC كندا – منحة الماجستير والدراسات العليا أونتاريو لB.B., والملكة إليزابيث الثانية منحة الدراسات العليا في العلوم والتكنولوجيا ل.S.S..
Materials
| 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 | Fisher Scientific | BP152-1 | Maintain at 4°C |
| 60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 174888 | |
| 6-well cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Acetonitrile, MS grade | Pierce | TS-51101 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1099510001 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850-1L | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | ThermoFisher Scientific | A643-500 | Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month. |
| Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System | Fisher Scientific | 13-717-300 | Not essential, serological pipettes can be used to remove media. |
| C18 resin | 3M Empore | 3M2215 | |
| Cell Scrapers | VWR | 10062-906 | Not essential, other methods to release macrophage cells can be used. |
| Centrifugal vaccuum concentrator | Eppendorf | 07-748-15 | |
| Complete Filtration Unit | VWR | 10040-436 | |
| Conical falcon tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Not essential, haemocytometer can be used as an alternative. |
| CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation |
| Haemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| High-performance liquid chromatography system | ThermoFisher Scientific | LC140 | Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples. |
| High-resolution mass spectrometer | ThermoFisher Scientific | 726042 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I6125 | Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| LoBind Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 13-698-794 | |
| MaxQuant | https://maxquant.org/ | MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 13864457 | |
| Penicillin : Streptomycin 10k/10k | VWR | CA12001-692 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| Peptide separation columns | ThermoFisher Scientific | ES803 | |
| Perseus Software | http://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phosphate Buffered Saline | VWR | CA12001-676 | Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use. |
| Pierce BCA Protein Assay | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pipette, Disposable Serological (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix | Fisher Scientific | 14955235 | |
| Probe sonciator | ThermoFisher Scientific | 100-132-894 | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ThermoFisher Scientific | 28364 | 20% (w/v) |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| STAGE tipping centrifuge | Sonation | STC-V2 | |
| Thermal Shaker | VWR | NO89232-908 | |
| Trifluoroacetic acid | ThermoFisher Scientific | 85183 | |
| Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade | Pierce | A40007 | Maintain at -20 °C. |
| Ultrasonic bath | Bransonic | A89375-450 | Stored in cold room (4C) |
| Urea | Sigma Aldrich | U1250-1KG | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| Yeast-extract peptone dextrose broth | BD Difco | BM20 |
Riferimenti
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. Journal of Fungi. , (2017).
- Tugume, L., et al. HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts. Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2017).
- Perfect, J. R. The antifungal pipeline: A reality check. Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).
- Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development. Journal of Fungi. , (2019).
- Sukumaran, A., et al. Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics. J Leukocyte Biol. , (2019).
- Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks. Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes. Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).
- Cox, J., et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics. Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. , (2011).
- Zhong, Z., Pirofski, L. A. Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies. Infection and Immunity. , (1996).
- Nicola, A. M., et al. Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans. Infection and Immunity. , (2012).
- Ball, B., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans. Current Protocols in Microbiology. , (2019).
- Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils. Current Protocols in Immunology. , (2019).
- Geddes, J. M. H., et al. Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A. BMC Microbiology. , (2015).
- Geddes, J. M. H., et al. Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation. mBio. 7 (1), 1-15 (2016).
- Al Shweiki, M. H. D. R., et al. Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance. Journal of Proteome Research. , (2017).
- Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Borner, G. H. H. Organellar Maps Through Proteomic Profiling – A Conceptual Guide. Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).
- Kugadas, A., et al. Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections. Journal of Leukocyte Biology. , (2019).
- Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface. Proteomics. , (2020).
- Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).
