Label-Free Kvantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Patogen Interaktioner
Summary
Her præsenterer vi en protokol til at profilere samspillet mellem vært og patogen under infektion med massespektrometri-baserede proteomics. Denne protokol bruger etiketfri kvantificering til at måle ændringer i proteintæthed for både vært (f.eks. makrofager) og patogen (f.eks. Cryptococcus neoformans)i et enkelt eksperiment.
Abstract
De teknologiske resultater af massespektrometri (MS)-baserede kvantitative proteomics åbner mange uopdagede muligheder for at analysere en organismes globale proteom under forskellige forhold. Denne kraftfulde strategi, der anvendes til samspillet mellem mikrobielle patogener med den ønskede vært, karakteriserer udførligt begge perspektiver mod infektion. Heri beskriver arbejdsgangen etiketfri kvantificering (LFQ) af infectome af Cryptococcus neoformans, et svampefakultetativt intracellulært patogen, der er årsagsmidlet til den dødelige sygdom cryptococcosis, i nærværelse af udødeliggjorte makrofagceller. Protokollen indeholder nærmere oplysninger om de korrekte proteinforberedelsesteknikker for både patogen- og pattedyrsceller i et enkelt forsøg, hvilket resulterer i passende peptidindsendelse med henblik på væskekromatografi (LC)-MS/MS-analyse. Den høje gennemstrømning generiske karakter af LFQ giver et bredt dynamisk udvalg af protein identifikation og kvantificering, samt overførbarhed til enhver vært-patogen infektion indstilling, opretholde ekstrem følsomhed. Metoden er optimeret til at katalogisere omfattende, upartiske protein overflod profiler af et patogen inden for infektion-efterligne betingelser. Specifikt giver den metode, der demonstreres her, vigtige oplysninger om C. neoformans patogenese, såsom proteinproduktion, der er nødvendig for virulens og identificerer kritiske værtsproteiner, der reagerer på mikrobiel invasion.
Introduction
Forekomsten af invasive svampeinfektioner er stærkt stigende og er korreleret med uacceptabelt høje dødelighedsrater, oftest rapporteret hos personer med immundefekt prædispositioner1. Cryptococcus neoformans er et berygtet opportunistisk svampepatogen, der er i stand til intracellulær overlevelse inden for værts makrofagceller. Utilstrækkelig svampedræbende intervention resulterer i svampeformidling og livstruende manifestationer af cryptococcal meningitis og meningoencephalitis2,3. Den globale stigning i immunkompromitteret status har krævet en parallel stigning i brugen af svampemidler, hvor mange svampearter, herunder C. neoformans , i stigende grad har udviklet resistens over for4,5,6. Derfor er det bydende nødvendigt at implementere robuste og effektive teknologier til at besvare vitale biologiske spørgsmål vedrørende værtsforsvarsrespons og mikrobiel patogenese.
Den nye tidsalder med teknologiske fremskridt inden for massespektrometri (MS), herunder generering af kraftige beregningsmæssige og bioinformatiske rørledninger, danner grundlaget for en integrativ vision for storstilet analyse af værtspatogenforskning7,8. Konventionel patogenesedrevet proteomisk analyse profilerer almindeligvis infektionssynet fra enten værts- eller patogenperspektivet, herunder omfattende metoder såsom proteinkorrelationsprofilering, affinitetskromatografi kombineret med proteomik og interactomics9. Undersøgelser af virulens af farlige patogener i et værtssystem er af enorm klinisk betydning; Anvendelsen af en analyse med to perspektiver i et enkelt eksperiment blev imidlertid tidligere anset for uopnåelig. For eksempel er patogenets perspektiv mod infektion ofte overvældet af meget rigelige værtsproteiner, hvilket resulterer i reduceret følsomhed til påvisning af lav-rigelige svampeproteiner7. Desuden opfordrer den høje prøvekompleksitet mange mål til at undersøge i et enkelt forsøgssystem og viser sig at være en udfordring at belyse virkningsmekanismer for et specifikt patogenprotein.
Bottom-up proteomics er en populær MS-teknik, der muliggør håndterbar prøveforberedelse, hvor peptider genereres af sekvensspecifik enzymatisk fordøjelse efterfulgt af væskekromatografiadskillelse, identifikation og kvantificering af MS10,11. Her præsenterer vi en metode, der demonstrerer en dataafhængig anskaffelsesstrategi med det formål at opnå en upartisk dækning af en infektionsbaseret proteom eller ‘infectome’. Specifikt, label-fri kvantificering (LFQ) kaster afhængighed af kemiske eller metaboliske etiketter for robust og præcis identifikation af protein niveau ændringer på tværs af flere proteomer, reducere prøve håndtering og forarbejdning trin12,13. Denne universelle applikation afhører producerede proteiner på et givet tidspunkt i en celle uafhængigt af enhver forventet proteinproduktion; således kan nye indsigter blive opdaget, der er afgørende for infektion.
Den arbejdsgang, der er beskrevet heri, er optimeret til at udforske ændringer i proteinniveauet i C. neoformans under infektions-efterlignende tilstande med værts immunceller (Figur 1). I stedet for at basere sig på isolering og adskillelse af celletyper udtrækker denne tilgang værts- og patogenproteomet sammen og anvender bioinformatatisk adskillelse ved hjælp af to organismespecifikke databaser til at skelne artsspecifik proteinproduktion. Denne metode giver fordele ved, at et ubegrænset antal prøver behandles uden de ekstra dyre forberedelsestrin, der er nødvendige i isotopbaserede mærkningsundersøgelser eller fraktionering. Desuden understøtter denne arbejdsgang optimerede proteinudvindingsprotokoller, der kan overføres til en bred vifte af svampe- og bakteriepatogener, der er i stand til at målrette og inficere værts immunceller. Samlet set skitserer denne protokol trinene til at fuldføre en upartisk proteinudvinding og prøvebehandling til ms i høj opløsning efterfulgt af data og statistisk analyse, der er i stand til at give et væld af viden om svampeproteiner, der er vigtige for infektion kombineret med omfattende profilering af værtsforsvarsresponset.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trin i protokollen omfatter forberedelse af makrofagceller og indsamling af co-kulturprøver til proteinbehandling med minimal forstyrrelse af cellerne. Det er vigtigt at udføre trin til vask, podning og fjernelse af vedhængende makrofagceller forsigtigt og omhyggeligt for at forhindre unødvendig lysis af celler før indsamling. Det er også afgørende at fastslå den korrekte MOI til forsøget, da podning med et for højt MOI kan forårsage hurtig makrofagcelledød og vanskeligheder med at indsamle og behand…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. Jonathan Krieger fra Bioinformatics Solutions Inc. for at drive massespektrometeret for repræsentative eksperimenter samt medlemmer af Geddes-McAlister-gruppen for deres hjælp med eksperimentel opsætning og manuskriptfeedback. Forfatterne anerkender delvist støtte til fra Banting Research Foundation – The Jarislowsky Fellowship Discovery Award, New Frontiers Research Fund – Exploration (NFRFE-2019-00425) og Canadian Foundation for Innovation (JELF 38798) for J.G.M., samt NSERC Canada Graduate Scholarship – Masters and Ontario Graduate Scholarship for B.B., og Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology for A.S..
Materials
| 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 | Fisher Scientific | BP152-1 | Maintain at 4°C |
| 60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 174888 | |
| 6-well cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Acetonitrile, MS grade | Pierce | TS-51101 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1099510001 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850-1L | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | ThermoFisher Scientific | A643-500 | Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month. |
| Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System | Fisher Scientific | 13-717-300 | Not essential, serological pipettes can be used to remove media. |
| C18 resin | 3M Empore | 3M2215 | |
| Cell Scrapers | VWR | 10062-906 | Not essential, other methods to release macrophage cells can be used. |
| Centrifugal vaccuum concentrator | Eppendorf | 07-748-15 | |
| Complete Filtration Unit | VWR | 10040-436 | |
| Conical falcon tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Not essential, haemocytometer can be used as an alternative. |
| CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation |
| Haemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| High-performance liquid chromatography system | ThermoFisher Scientific | LC140 | Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples. |
| High-resolution mass spectrometer | ThermoFisher Scientific | 726042 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I6125 | Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| LoBind Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 13-698-794 | |
| MaxQuant | https://maxquant.org/ | MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 13864457 | |
| Penicillin : Streptomycin 10k/10k | VWR | CA12001-692 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| Peptide separation columns | ThermoFisher Scientific | ES803 | |
| Perseus Software | http://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phosphate Buffered Saline | VWR | CA12001-676 | Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use. |
| Pierce BCA Protein Assay | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pipette, Disposable Serological (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix | Fisher Scientific | 14955235 | |
| Probe sonciator | ThermoFisher Scientific | 100-132-894 | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ThermoFisher Scientific | 28364 | 20% (w/v) |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| STAGE tipping centrifuge | Sonation | STC-V2 | |
| Thermal Shaker | VWR | NO89232-908 | |
| Trifluoroacetic acid | ThermoFisher Scientific | 85183 | |
| Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade | Pierce | A40007 | Maintain at -20 °C. |
| Ultrasonic bath | Bransonic | A89375-450 | Stored in cold room (4C) |
| Urea | Sigma Aldrich | U1250-1KG | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| Yeast-extract peptone dextrose broth | BD Difco | BM20 |
Riferimenti
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. Journal of Fungi. , (2017).
- Tugume, L., et al. HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts. Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2017).
- Perfect, J. R. The antifungal pipeline: A reality check. Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).
- Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development. Journal of Fungi. , (2019).
- Sukumaran, A., et al. Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics. J Leukocyte Biol. , (2019).
- Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks. Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes. Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).
- Cox, J., et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics. Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. , (2011).
- Zhong, Z., Pirofski, L. A. Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies. Infection and Immunity. , (1996).
- Nicola, A. M., et al. Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans. Infection and Immunity. , (2012).
- Ball, B., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans. Current Protocols in Microbiology. , (2019).
- Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils. Current Protocols in Immunology. , (2019).
- Geddes, J. M. H., et al. Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A. BMC Microbiology. , (2015).
- Geddes, J. M. H., et al. Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation. mBio. 7 (1), 1-15 (2016).
- Al Shweiki, M. H. D. R., et al. Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance. Journal of Proteome Research. , (2017).
- Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Borner, G. H. H. Organellar Maps Through Proteomic Profiling – A Conceptual Guide. Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).
- Kugadas, A., et al. Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections. Journal of Leukocyte Biology. , (2019).
- Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface. Proteomics. , (2020).
- Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).
