Flux de travail quantitatif protéomique sans étiquette pour les interactions hôte-pathogène axées sur la découverte
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour profiler l’interaction entre l’hôte et l’agent pathogène pendant l’infection par protéomique basée sur la spectrométrie de masse. Ce protocole utilise une quantification sans étiquette pour mesurer les changements dans l’abondance des protéines de l’hôte (p. ex., macrophages) et de l’agent pathogène (p. ex., cryptococcus néoformans)en une seule expérience.
Abstract
Les réalisations technologiques de la protéomique quantitative basée sur la spectrométrie de masse (SP) ouvrent de nombreuses voies inconnues pour analyser le protéome global d’un organisme dans des conditions variables. Cette stratégie puissante appliquée aux interactions des pathogènes microbiens avec l’hôte désiré caractérise globalement les deux perspectives vers l’infection. Dans ce cas, le flux de travail décrit la quantification sans étiquette (LFQ) de l’infectome des néoformans Cryptococcus, un pathogène intracellulaire fongique qui est l’agent causal de la cryptococcose mortelle de la maladie, en présence de cellules macrophages immortalisées. Le protocole détaille les techniques appropriées de préparation des protéines pour les cellules pathogènes et mammifères au cours d’une seule expérience, ce qui donne lieu à une soumission appropriée de peptides pour l’analyse liquide-chromatographie (LC)-MS/SP. La nature générique à haut débit de LFQ permet une large gamme dynamique d’identification et de quantification des protéines, ainsi que la transférabilité à n’importe quel paramètre d’infection hôte-pathogène, maintenant une sensibilité extrême. La méthode est optimisée pour cataloguer des profils étendus et impartiaux d’abondance de protéines d’un agent pathogène dans des conditions imitant l’infection. Plus précisément, la méthode démontrée ici fournit des informations essentielles sur la pathogénie c. néoformans, telles que la production de protéines nécessaires à la virulence et identifie les protéines hôtes critiques répondant à l’invasion microbienne.
Introduction
La prévalence des infections fongiques invasives augmente considérablement et est corrélée avec des taux de mortalité inacceptablement élevés, le plus souvent signalés chez les personnes ayant des prédispositions immunodéficientes1. Cryptococcus neoformans est un pathogène fongique opportuniste notoire capable de survie intracellulaire dans les cellules macrophages hôtes. L’intervention antifongique inadéquate a comme résultat la diffusion fongique et les manifestations représentant un danger pour la vie de la méningite cryptococcique et de la méningoencéphalite2,3. L’augmentation mondiale du statut immunocompromisé a exigé une augmentation parallèle de l’utilisation d’agents antifongiques, dans laquelle de nombreuses espèces fongiques, y compris les néoformans C. ont de plus en plus évolué résistance vers4,5,6. Par conséquent, il est impératif de mettre en œuvre des technologies robustes et efficaces pour répondre aux questions biologiques vitales concernant la réponse de la défense de l’hôte et la pathogénie microbienne.
La nouvelle ère du progrès technologique en spectrométrie de masse (SP), y compris la génération de puissants pipelines informatiques et bioinformatiques, fournit les bases d’une vision intégrative pour l’analyse à grande échelle de la recherche sur les pathogèneshôtes 7,8. L’analyse protéomique conventionnelle axée sur la pathogénie dresse généralement le portrait de l’infection du point de vue de l’hôte ou de l’agent pathogène, y compris des méthodologies complètes telles que le profilage de corrélation protéique, la chromatographie par affinité combinée à la protéomique et l’interactomique9. Les études sur la virulence des agents pathogènes dangereux dans un système hôte sont d’une immense importance clinique; toutefois, l’application d’une analyse à double perspective dans une seule expérience était autrefois considérée comme inaccessible. Par exemple, la perspective de l’agent pathogène à l’égard de l’infection est souvent submergée par des protéines hôtes très abondantes, ce qui réduit la sensibilité à la détection de protéines fongiquesfaiblement abondantes 7. En outre, la grande complexité de l’échantillon invite de nombreuses cibles à étudier dans un seul système expérimental et s’avère difficile à élucider les mécanismes d’action pour une protéine pathogène spécifique.
La protéomique ascendante est une technique populaire de SP qui permet une préparation gérable de l’échantillon, dans laquelle les peptides sont générés par digestion enzymatique spécifique à la séquence suivie d’une séparation, d’une identification et d’une quantification de la chromatographie liquide par MS10,11. Ici, nous présentons une méthode démontrant une stratégie d’acquisition dépendante des données visant à atteindre une couverture impartiale d’un protéome ou d’un « infectome » basé sur l’infection. Plus précisément, la quantification sans étiquette (LFQ) réduit la dépendance à l’égard des étiquettes chimiques ou métaboliques pour une identification robuste et précise des changements de niveau de protéines à travers de multiples protéomes, réduisant ainsi les étapes de manipulation et de traitementdes échantillons 12,13. Cette application universelle interroge les protéines produites à un moment donné au sein d’une cellule indépendante de toute production de protéines attendue; ainsi, de nouvelles idées peuvent être découvertes qui sont critiques à l’infection.
Le flux de travail décrit ci-après est optimisé pour explorer les changements de niveau de protéines des néoformans C. pendant les conditions d’imitation de l’infection avec les cellules immunitaires hôtes ( figure1). Plutôt que de s’appuyer sur l’isolement et la séparation des types de cellules, cette approche extrait ensemble le protéome de l’hôte et de l’agent pathogène, et utilise la séparation bioinformatique à l’aide de deux bases de données spécifiques à l’organisme pour distinguer la production de protéines propres à chaque espèce. Cette méthode offre des avantages pour un nombre illimité d’échantillons à traiter sans les étapes de préparation supplémentaires coûteuses nécessaires dans les études d’étiquetage à base d’isotopes ou la fractionnement. En outre, ce flux de travail prend en charge des protocoles optimisés d’extraction de protéines transférables à un large éventail d’agents pathogènes fongiques et bactériens capables de cibler et d’infecter les cellules immunitaires hôtes. Dans l’ensemble, ce protocole décrit les étapes à suivre pour effectuer une extraction impartiale des protéines et le traitement de l’échantillon pour la SP à haute résolution, suivi de données et d’analyses statistiques, capables de fournir une mine de connaissances sur les protéines fongiques importantes pour l’infection combinées à un profilage complet de la réponse de la défense de l’hôte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes critiques du protocole comprennent la préparation des cellules macrophages et la collecte d’échantillons de co-culture pour le traitement des protéines avec une perturbation minimale des cellules. Il est important d’effectuer des étapes de lavage, d’inoculation et d’élimination des cellules macrophages adhérentes doucement et soigneusement pour prévenir la lyse inutile des cellules avant la collecte. Il est également essentiel d’établir le moi correct pour l’expérience, car l’inocculat…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Dr Jonathan Krieger de Bioinformatics Solutions Inc. d’avoir exploité le spectromètre de masse pour des expériences représentatives, ainsi que les membres du groupe Geddes-McAlister pour leur aide à la mise en place expérimentale et à la rétroaction manuscrite. Les auteurs reconnaissent le soutien financier, en partie, de la Banting Research Foundation – The Jarislowsky Fellowship Discovery Award, New Frontiers Research Fund – Exploration (NFRFE-2019-00425), et de la Fondation canadienne pour l’innovation (JELF 38798) pour J.G.M., ainsi que de la Bourse d’études supérieures du CRSN Canada – Maîtrise et bourse d’études supérieures de l’Ontario pour B.B., et bourse d’études supérieures Queen Elizabeth II en sciences et technologie pour les A.S.
Materials
| 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 | Fisher Scientific | BP152-1 | Maintain at 4°C |
| 60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 174888 | |
| 6-well cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Acetonitrile, MS grade | Pierce | TS-51101 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1099510001 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850-1L | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | ThermoFisher Scientific | A643-500 | Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month. |
| Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System | Fisher Scientific | 13-717-300 | Not essential, serological pipettes can be used to remove media. |
| C18 resin | 3M Empore | 3M2215 | |
| Cell Scrapers | VWR | 10062-906 | Not essential, other methods to release macrophage cells can be used. |
| Centrifugal vaccuum concentrator | Eppendorf | 07-748-15 | |
| Complete Filtration Unit | VWR | 10040-436 | |
| Conical falcon tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Not essential, haemocytometer can be used as an alternative. |
| CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation |
| Haemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| High-performance liquid chromatography system | ThermoFisher Scientific | LC140 | Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples. |
| High-resolution mass spectrometer | ThermoFisher Scientific | 726042 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I6125 | Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| LoBind Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 13-698-794 | |
| MaxQuant | https://maxquant.org/ | MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 13864457 | |
| Penicillin : Streptomycin 10k/10k | VWR | CA12001-692 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| Peptide separation columns | ThermoFisher Scientific | ES803 | |
| Perseus Software | http://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phosphate Buffered Saline | VWR | CA12001-676 | Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use. |
| Pierce BCA Protein Assay | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pipette, Disposable Serological (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix | Fisher Scientific | 14955235 | |
| Probe sonciator | ThermoFisher Scientific | 100-132-894 | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ThermoFisher Scientific | 28364 | 20% (w/v) |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| STAGE tipping centrifuge | Sonation | STC-V2 | |
| Thermal Shaker | VWR | NO89232-908 | |
| Trifluoroacetic acid | ThermoFisher Scientific | 85183 | |
| Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade | Pierce | A40007 | Maintain at -20 °C. |
| Ultrasonic bath | Bransonic | A89375-450 | Stored in cold room (4C) |
| Urea | Sigma Aldrich | U1250-1KG | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| Yeast-extract peptone dextrose broth | BD Difco | BM20 |
Riferimenti
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. Journal of Fungi. , (2017).
- Tugume, L., et al. HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts. Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2017).
- Perfect, J. R. The antifungal pipeline: A reality check. Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).
- Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development. Journal of Fungi. , (2019).
- Sukumaran, A., et al. Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics. J Leukocyte Biol. , (2019).
- Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks. Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes. Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).
- Cox, J., et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics. Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. , (2011).
- Zhong, Z., Pirofski, L. A. Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies. Infection and Immunity. , (1996).
- Nicola, A. M., et al. Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans. Infection and Immunity. , (2012).
- Ball, B., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans. Current Protocols in Microbiology. , (2019).
- Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils. Current Protocols in Immunology. , (2019).
- Geddes, J. M. H., et al. Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A. BMC Microbiology. , (2015).
- Geddes, J. M. H., et al. Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation. mBio. 7 (1), 1-15 (2016).
- Al Shweiki, M. H. D. R., et al. Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance. Journal of Proteome Research. , (2017).
- Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Borner, G. H. H. Organellar Maps Through Proteomic Profiling – A Conceptual Guide. Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).
- Kugadas, A., et al. Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections. Journal of Leukocyte Biology. , (2019).
- Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface. Proteomics. , (2020).
- Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).
