डिस्कवरी-संचालित होस्ट-रोगजनक इंटरैक्शन के लिए लेबल-फ्री क्वांटिटेटिव प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो
Summary
यहां, हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटेओमिक्स द्वारा संक्रमण के दौरान मेजबान और रोगजनक के बीच परस्पर क्रिया को प्रोफाइल करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह प्रोटोकॉल एक ही प्रयोग में दोनों मेजबान (जैसे, मैक्रोफेज) और रोगजनक (जैसे क्रिप्टोकसस नियोफॉर्मन)के प्रोटीन प्रचुरता में परिवर्तन को मापने के लिए लेबल-मुक्त मात्राकरण का उपयोग करता है।
Abstract
मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स की तकनीकी उपलब्धियां अलग-अलग परिस्थितियों में किसी जीव के वैश्विक प्रोटेम का विश्लेषण करने के लिए कई अनदेखा रास्ते खोलती हैं। वांछित मेजबान के साथ माइक्रोबियल रोगजनकों की बातचीत पर लागू यह शक्तिशाली रणनीति संक्रमण के प्रति दोनों दृष्टिकोणों को व्यापक रूप से चित्रित करती है। इसके साथ ही, वर्कफ्लो में क्रिप्टोकोकस नियोफॉर्मन्स के इंफ्रेक्टोम के लेबल-फ्री क्वांटिफिकेशन (एलएफक्यू) का वर्णन किया गया है, जो एक फंगल फैकल्टी इनट्रासेलुलर रोगजनक है जो अमर मैक्रोफेज कोशिकाओं की उपस्थिति में घातक रोग क्रिप्टोकॉकोसिस का कारक एजेंट है। प्रोटोकॉल में एक ही प्रयोग के भीतर रोगजनक और स्तनधारी कोशिकाओं दोनों के लिए उचित प्रोटीन तैयारी तकनीकों का विवरण दिया गया है, जिसके परिणामस्वरूप तरल-क्रोमेटोग्राफी (एलसी)-एमएस/एमएस विश्लेषण के लिए उपयुक्त पेप्टाइड सबमिशन होता है । एलएफक्यू की उच्च थ्रूपुट जेनेरिक प्रकृति प्रोटीन पहचान और मात्राकरण की एक विस्तृत गतिशील श्रृंखला की अनुमति देती है, साथ ही किसी भी मेजबान-रोगजनक संक्रमण सेटिंग में हस्तांतरणशीलता, अत्यधिक संवेदनशीलता को बनाए रखते हैं। विधि संक्रमण-नकल करने वाली स्थितियों के भीतर एक रोगजनक के व्यापक, निष्पक्ष प्रोटीन बहुतायत प्रोफाइल को सूचीबद्ध करने के लिए अनुकूलित है। विशेष रूप से, यहां प्रदर्शित विधि सी नियोफॉर्मन रोगजनकों के बारे में आवश्यक जानकारी प्रदान करती है, जैसे कि उग्रता के लिए आवश्यक प्रोटीन उत्पादन और माइक्रोबियल आक्रमण का जवाब देने वाले महत्वपूर्ण मेजबान प्रोटीन की पहचान करता है।
Introduction
आक्रामक फंगल संक्रमणों की व्यापकता काफी बढ़ रही है और अस्वीकार्य रूप से उच्च मृत्यु दर के साथ सहसंबद्ध है, जो आमतौर पर इम्यूनोडिनेस प्रीडिस्टेंस1वाले व्यक्तियों में रिपोर्ट की जाती है। क्रिप्टोकोकस नियोफॉर्मेन एक कुख्यात अवसरवादी फंगल रोगजनक है जो मेजबान मैक्रोफेज कोशिकाओं के भीतर इंट्रासेलर अस्तित्व में सक्षम है। अपर्याप्त एंटीफंगल हस्तक्षेप के परिणामस्वरूप क्रिप्टोकोकल मेनिनजाइटिस और मेनिंगोएंसेफलाइटिस2,3के फंगल प्रसार और जीवन-धमकी वाले अभिव्यक्तियां होती हैं। इम्यूनोसमझौता की स्थिति में वैश्विक वृद्धि ने एंटीफंगल एजेंटों के उपयोग में समानांतर वृद्धि की मांग की है, जिसमें सी नियोफॉर्मन सहित कई फंगल प्रजातियोंने4,5,6के प्रति तेजी से प्रतिरोध विकसित किया है। इसलिए, मेजबान रक्षा प्रतिक्रिया और माइक्रोबियल रोगजनकता के बारे में महत्वपूर्ण जैविक सवालों के जवाब देने के लिए मजबूत और कुशल प्रौद्योगिकियों को लागू करना अनिवार्य है ।
शक्तिशाली कंप्यूटेशनल और बायोइंफॉर्मेटिक्स पाइपलाइनों की पीढ़ी सहित मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) में तकनीकी उन्नति का नया युग, मेजबान-रोगजनक अनुसंधान7,8के बड़े पैमाने पर विश्लेषण के लिए एक एकीकृत दृष्टि की नींव प्रदान करता है। पारंपरिक रोगजनकता-चालित प्रोटेओमिक विश्लेषण आमतौर पर मेजबान या रोगजनक परिप्रेक्ष्य से संक्रमण के दृश्य को प्रोफाइल करता है, जिसमें प्रोटीन सहसंबंध प्रोफाइलिंग, प्रोटेओमिक्स के साथ संयुक्त आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी और इंटरैक्टॉमिक्स9जैसे व्यापक तरीके शामिल हैं। मेजबान प्रणाली में खतरनाक रोगजनकों की उग्रता की जांच बहुत नैदानिक महत्व की है; हालांकि, एक ही प्रयोग में दोहरे परिप्रेक्ष्य विश्लेषण के आवेदन को पूर्व में अप्राप्य माना जाता था। उदाहरण के लिए, संक्रमण के प्रति रोगजनक का परिप्रेक्ष्य अक्सर अत्यधिक प्रचुर मात्रा में मेजबान प्रोटीन से अभिभूत होता है जिसके परिणामस्वरूप कम प्रचुर मात्रा में फंगल प्रोटीन का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता कम होती है7। इसके अलावा, उच्च नमूना जटिलता एक ही प्रयोगात्मक प्रणाली में जांच करने के लिए कई लक्ष्यों को आमंत्रित करती है और एक विशिष्ट रोगजनक प्रोटीन के लिए कार्रवाई के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए चुनौतीपूर्ण साबित होती है।
बॉटम-अप प्रोटेओमिक्स एक लोकप्रिय एमएस तकनीक है जो प्रबंधनीय नमूना तैयारी को सक्षम बनाती है, जिसमें पेप्टाइड्स अनुक्रम-विशिष्ट एंजाइमैटिक पाचन द्वारा उत्पन्न होते हैं जिसके बाद तरल क्रोमेटोग्राफी पृथक्करण, पहचान और एमएस10,11द्वारा मात्राकरण होता है। यहां, हम एक संक्रमण आधारित प्रोटेम या ‘इंफ्फोम’ के निष्पक्ष कवरेज को प्राप्त करने के उद्देश्य से डेटा-निर्भर अधिग्रहण रणनीति का प्रदर्शन करने वाली एक विधि पेश करते हैं। विशेष रूप से, लेबल-मुक्त मात्राकरण (एलएफक्यू) कई प्रोटियोम्स में प्रोटीन स्तर के परिवर्तनों की मजबूत और सटीक पहचान के लिए रासायनिक या मेटाबोलिक लेबल पर निर्भरता डालता है, नमूना हैंडलिंग और प्रसंस्करण चरणों को कम करता है12,13। यह सार्वभौमिक आवेदन किसी भी अपेक्षित प्रोटीन उत्पादन से स्वतंत्र सेल के भीतर किसी भी समय उत्पादित प्रोटीन से पूछताछ करता है; इस प्रकार, उपन्यास अंतर्दृष्टि की खोज की जा सकती है जो संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण हैं।
यहां वर्णित वर्कफ्लो को मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं(चित्रा 1)के साथ संक्रमण-नकल करने वाली स्थितियों के दौरान सी नियोफॉर्मन के प्रोटीन स्तर के परिवर्तनों का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जाता है। सेल प्रकारों के अलगाव और पृथक्करण पर निर्भर होने के बजाय, यह दृष्टिकोण मेजबान और रोगजनक प्रोटेम को एक साथ निकालता है, और प्रजातियों-विशिष्ट प्रोटीन उत्पादन को अलग करने के लिए दो जीव-विशिष्ट डेटाबेस का उपयोग करके जैव सूचनाओं के पृथक्करण का उपयोग करता है। यह विधि आइसोटोप-आधारित लेबलिंग अध्ययन या अंश में आवश्यक अतिरिक्त महंगी तैयारी चरणों के बिना संसाधित किए जाने वाले नमूनों की असीमित संख्या के लिए लाभ प्रदान करती है। इसके अलावा, यह वर्कफ्लो अनुकूलित प्रोटीन निष्कर्षण प्रोटोकॉल का समर्थन करता है जो मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं को लक्षित और संक्रमित करने में सक्षम फंगल और बैक्टीरियल रोगजनकों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए हस्तांतरणीय है। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल उच्च-रिज़ॉल्यूशन एमएस के लिए एक निष्पक्ष प्रोटीन निष्कर्षण और नमूना प्रसंस्करण को पूरा करने के लिए कदमों को रेखांकित करता है, जिसके बाद डेटा और सांख्यिकीय विश्लेषण होता है, जो मेजबान रक्षा प्रतिक्रिया की व्यापक प्रोफाइलिंग के साथ संयुक्त संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण फंगल प्रोटीन के ज्ञान का खजाना प्रदान करने में सक्षम होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों में मैक्रोफेज कोशिकाओं को तैयार करना और कोशिकाओं को न्यूनतम व्यवधान के साथ प्रोटीन प्रसंस्करण के लिए सह-संस्कृति नमूनों का संग्रह शामिल है। संग्रह से पहले कोशिकाओं क?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक प्रतिनिधि प्रयोगों के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के संचालन के लिए बायोइन्फॉर्मेटिक्स सॉल्यूशंस इंक के डॉ जोनाथन क्रिगर को धन्यवाद देते हैं, साथ ही प्रयोगात्मक सेट-अप और पांडुलिपि प्रतिक्रिया के साथ उनकी सहायता के लिए गेड्स-मैकएलिस्टर समूह के सदस्यों को भी धन्यवाद देते हैं। लेखकों के वित्तपोषण का समर्थन स्वीकार करते हैं, भाग में, बैंटिंग रिसर्च फाउंडेशन से – जारिस्लोस्की फैलोशिप डिस्कवरी अवार्ड, न्यू फ्रंटियर्स रिसर्च फंड – एक्सप्लोरेशन (एनएफएफएफई-2019-00425), और जेजी.M के लिए कनाडाई फाउंडेशन फॉर इनोवेशन (जेईएलएफ 38798), साथ ही एनएसईआरसी कनाडा ग्रेजुएट स्कॉलरशिप – बी.B के लिए मास्टर्स और ग्रेजुएट ओंटारियो स्कॉलरशिप और क्वीन एलिजाबेथ II ग्रेजुएट स्कॉलरशिप इन साइंस एंड टेक्नोलॉजी।
Materials
| 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 | Fisher Scientific | BP152-1 | Maintain at 4°C |
| 60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 174888 | |
| 6-well cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Acetonitrile, MS grade | Pierce | TS-51101 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1099510001 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850-1L | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | ThermoFisher Scientific | A643-500 | Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month. |
| Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System | Fisher Scientific | 13-717-300 | Not essential, serological pipettes can be used to remove media. |
| C18 resin | 3M Empore | 3M2215 | |
| Cell Scrapers | VWR | 10062-906 | Not essential, other methods to release macrophage cells can be used. |
| Centrifugal vaccuum concentrator | Eppendorf | 07-748-15 | |
| Complete Filtration Unit | VWR | 10040-436 | |
| Conical falcon tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Not essential, haemocytometer can be used as an alternative. |
| CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation |
| Haemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| High-performance liquid chromatography system | ThermoFisher Scientific | LC140 | Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples. |
| High-resolution mass spectrometer | ThermoFisher Scientific | 726042 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I6125 | Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| LoBind Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 13-698-794 | |
| MaxQuant | https://maxquant.org/ | MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 13864457 | |
| Penicillin : Streptomycin 10k/10k | VWR | CA12001-692 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| Peptide separation columns | ThermoFisher Scientific | ES803 | |
| Perseus Software | http://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phosphate Buffered Saline | VWR | CA12001-676 | Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use. |
| Pierce BCA Protein Assay | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pipette, Disposable Serological (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix | Fisher Scientific | 14955235 | |
| Probe sonciator | ThermoFisher Scientific | 100-132-894 | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ThermoFisher Scientific | 28364 | 20% (w/v) |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| STAGE tipping centrifuge | Sonation | STC-V2 | |
| Thermal Shaker | VWR | NO89232-908 | |
| Trifluoroacetic acid | ThermoFisher Scientific | 85183 | |
| Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade | Pierce | A40007 | Maintain at -20 °C. |
| Ultrasonic bath | Bransonic | A89375-450 | Stored in cold room (4C) |
| Urea | Sigma Aldrich | U1250-1KG | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| Yeast-extract peptone dextrose broth | BD Difco | BM20 |
Riferimenti
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