Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa sem rótulo para interações de patógenos de host-pathogen orientadas para a descoberta
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para traçar o perfil entre hospedeiro e patógeno durante a infecção por proteômica baseada em espectrometria de massa. Este protocolo usa quantificação livre de rótulos para medir mudanças na abundância de proteínas tanto do hospedeiro (por exemplo, macrófagos) quanto de patógenos (por exemplo, Cryptococcus neoformans) em um único experimento.
Abstract
As realizações tecnológicas da proteômica quantitativa baseada em espectrometria de massa (MS) abrem muitas vias desconhecidas para analisar o proteome global de um organismo em condições variadas. Esta poderosa estratégia aplicada às interações de patógenos microbianos com o hospedeiro desejado caracteriza de forma abrangente ambas as perspectivas para a infecção. Aqui, o fluxo de trabalho descreve a quantificação sem rótulos (LFQ) do infectome de Cryptococcus neoformans, um patógeno intracelular facultativo fúngico que é o agente causador da doença mortal criptococcose, na presença de células macrófagos imortalizadas. O protocolo detalha as técnicas adequadas de preparação de proteínas para células patógenas e mamíferos dentro de um único experimento, resultando em submissão adequada de peptídeos para análise de cromatografia líquida (LC)-MS/MS. A natureza genérica de alto rendimento do LFQ permite uma ampla gama dinâmica de identificação e quantificação de proteínas, bem como transferência para qualquer configuração de infecção por hospedeiro-patógeno, mantendo extrema sensibilidade. O método é otimizado para catalogar perfis extensos e imparcial de abundância de proteínas de um patógeno em condições de imitação de infecções. Especificamente, o método aqui demonstrado fornece informações essenciais sobre a patogênese C. neoformans, como a produção de proteínas necessárias para a virulência e identifica proteínas críticas de hospedeiro que respondem à invasão microbiana.
Introduction
A prevalência de infecções fúngicas invasivas está aumentando muito e está correlacionada com taxas inaceitáveis de mortalidade elevadas, mais comumente relatadas em indivíduos com predisposições imunodeficientes1. Cryptococcus neoformans é um notória patógeno fúngico oportunista capaz de sobrevivência intracelular dentro de células macrófagos hospedeiras. Intervenção antifúngica inadequada resulta em disseminação fúngica e manifestações de risco de vida de meningite criptocócica e meningoencefalite2,3. O aumento global do status imunocomprometido exigiu um aumento paralelo no uso de agentes antifúngicos, nos quais muitas espécies fúngicas, incluindo C. neoformans, têm evoluído cada vez mais resistência para4,5,6. Portanto, é imprescindível implementar tecnologias robustas e eficientes para responder a questões biológicas vitais sobre resposta à defesa do hospedeiro e patogênese microbiana.
A nova era do avanço tecnológico na espectrometria de massa (MS), incluindo a geração de poderosos gasodutos computacionais e bioinforáticos, fornece a base para uma visão integrativa para análise em larga escala da pesquisa hospedeira-patógeno7,8. A análise proteômica convencional orientada pela patogênese geralmente perfila a visão da infecção da perspectiva hospedeira ou patógena, incluindo metodologias abrangentes como perfil de correlação de proteínas, cromatografia de afinidade combinada com proteômica e interactomics9. As investigações sobre a virulência de patógenos perigosos em um sistema hospedeiro são de imensa importância clínica; no entanto, a aplicação de uma análise de dupla perspectiva em um único experimento foi anteriormente considerada inatingível. Por exemplo, a perspectiva do patógeno em relação à infecção é frequentemente sobrecarregada por proteínas hospedeiras altamente abundantes, resultando em sensibilidade reduzida para a detecção de proteínas fúngicas de baixa abundantes7. Além disso, a alta complexidade amostral convida muitos alvos a investigar em um único sistema experimental e se mostra desafiador para elucidar mecanismos de ação para uma proteína patógena específica.
A proteômica de baixo para cima é uma técnica popular de MS que permite a preparação de amostras gerenciáveis, na qual os peptídeos são gerados pela digestão enzimática específica da sequência seguida pela separação, identificação e quantificação da cromatografia líquida pela MS10,11. Aqui, apresentamos um método demonstrando uma estratégia de aquisição dependente de dados com o objetivo de alcançar uma cobertura imparcial de um proteome baseado em infecção ou “infectome”. Especificamente, a quantificação sem rótulos (LFQ) libera a dependência de rótulos químicos ou metabólicos para identificação robusta e precisa de alterações no nível de proteínas em múltiplos proteomes, reduzindo as etapas de manuseio e processamento de amostras12,13. Esta aplicação universal interroga proteínas produzidas em um dado momento dentro de uma célula independente de qualquer produção de proteína esperada; assim, novos insights podem ser descobertos que são críticos para a infecção.
O fluxo de trabalho descrito aqui é otimizado para explorar mudanças no nível de proteína de C. neoformans durante condições de imitação de infecções com células imunes hospedeiras(Figura 1). Em vez de depender do isolamento e separação dos tipos celulares, essa abordagem extrai o hospedeiro e o proteome patógeno juntos, e utiliza a separação bioinformática usando dois bancos de dados específicos do organismo para distinguir a produção de proteínas específicas das espécies. Este método oferece vantagens para um número ilimitado de amostras a serem processadas sem as etapas de preparação extra dispendias necessárias em estudos de rotulagem ou fracionamento baseados em isótopos. Além disso, este fluxo de trabalho suporta protocolos otimizados de extração de proteínas transferíveis para uma ampla gama de patógenos fúngicos e bacterianos capazes de atingir e infectar células imunes hospedeiras. No geral, este protocolo descreve as etapas para concluir uma extração de proteína imparcial e processamento de amostras para MS de alta resolução, seguida de dados e análise estatística, capaz de fornecer uma riqueza de conhecimento de proteínas fúngicas significativas para infecção combinada com o perfil abrangente da resposta à defesa do hospedeiro.
Protocol
Representative Results
Discussion
As etapas críticas do protocolo incluem a preparação de células macrófagos e a coleta de amostras de co-cultura para processamento de proteínas com interrupção mínima das células. É importante realizar etapas de lavagem, inoculação e remoção de células macrófagos aderentes suavemente e cuidadosamente para evitar a lise desnecessária das células antes da coleta. Estabelecer o MOI correto para o experimento também é fundamental, pois a inoculação com um MOI excessivamente alto pode causar morte rápi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Dr. Jonathan Krieger da Bioinformatics Solutions Inc. por operar o espectrômetro de massa para experimentos representativos, bem como membros do grupo Geddes-McAlister por sua assistência com configuração experimental e feedback de manuscritos. Os autores reconhecem o apoio ao financiamento, em parte, da Fundação de Pesquisa Banting – The Jarislowsky Fellowship Discovery Award, New Frontiers Research Fund – Exploration (NFRFE-2019-00425), e da Canadian Foundation for Innovation (JELF 38798) para J.G.M., bem como bolsa de pós-graduação da NSERC Canada – Mestrado e Bolsa de Pós-Graduação de Ontário para B.B., e Bolsa de Pós-Graduação Rainha Elizabeth II em Ciência e Tecnologia para A.S..
Materials
| 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 | Fisher Scientific | BP152-1 | Maintain at 4°C |
| 60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 174888 | |
| 6-well cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Acetonitrile, MS grade | Pierce | TS-51101 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1099510001 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850-1L | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | ThermoFisher Scientific | A643-500 | Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month. |
| Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System | Fisher Scientific | 13-717-300 | Not essential, serological pipettes can be used to remove media. |
| C18 resin | 3M Empore | 3M2215 | |
| Cell Scrapers | VWR | 10062-906 | Not essential, other methods to release macrophage cells can be used. |
| Centrifugal vaccuum concentrator | Eppendorf | 07-748-15 | |
| Complete Filtration Unit | VWR | 10040-436 | |
| Conical falcon tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Not essential, haemocytometer can be used as an alternative. |
| CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation |
| Haemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| High-performance liquid chromatography system | ThermoFisher Scientific | LC140 | Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples. |
| High-resolution mass spectrometer | ThermoFisher Scientific | 726042 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I6125 | Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| LoBind Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 13-698-794 | |
| MaxQuant | https://maxquant.org/ | MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 13864457 | |
| Penicillin : Streptomycin 10k/10k | VWR | CA12001-692 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| Peptide separation columns | ThermoFisher Scientific | ES803 | |
| Perseus Software | http://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phosphate Buffered Saline | VWR | CA12001-676 | Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use. |
| Pierce BCA Protein Assay | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pipette, Disposable Serological (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix | Fisher Scientific | 14955235 | |
| Probe sonciator | ThermoFisher Scientific | 100-132-894 | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ThermoFisher Scientific | 28364 | 20% (w/v) |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| STAGE tipping centrifuge | Sonation | STC-V2 | |
| Thermal Shaker | VWR | NO89232-908 | |
| Trifluoroacetic acid | ThermoFisher Scientific | 85183 | |
| Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade | Pierce | A40007 | Maintain at -20 °C. |
| Ultrasonic bath | Bransonic | A89375-450 | Stored in cold room (4C) |
| Urea | Sigma Aldrich | U1250-1KG | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| Yeast-extract peptone dextrose broth | BD Difco | BM20 |
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