Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa sin etiquetas para interacciones host-patógenos impulsadas por el descubrimiento
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para perfilar la interacción entre el huésped y el patógeno durante la infección por proteómica basada en espectrometría de masas. Este protocolo utiliza la cuantificación libre de etiquetas para medir los cambios en la abundancia de proteínas tanto del huésped (por ejemplo, macrófagos) como del patógeno (por ejemplo, Cryptococcus neoformans)en un solo experimento.
Abstract
Los logros tecnológicos de la proteómica cuantitativa basada en espectrometría de masas (EM) abren muchas vías no descubiertas para analizar el proteoma global de un organismo en condiciones variables. Esta poderosa estrategia aplicada a las interacciones de patógenos microbianos con el huésped deseado caracteriza ampliamente ambas perspectivas hacia la infección. En este documento, el flujo de trabajo describe la cuantificación libre de etiquetas (LFQ) del infectoma de Cryptococcus neoformans, un patógeno intracelular facultativo facultativo fúngico que es el agente causal de la enfermedad mortal cryptococcosis, en presencia de células de macrófago inmortalizadas. El protocolo detalla las técnicas adecuadas de preparación de proteínas para células patógenas y mamíferos dentro de un solo experimento, lo que resulta en la presentación adecuada de péptidos para el análisis de cromatografía líquida (LC)-EM/EM. La naturaleza genérica de alto rendimiento de LFQ permite un amplio rango dinámico de identificación y cuantificación de proteínas, así como transferibilidad a cualquier entorno de infección de patógeno huésped, manteniendo una sensibilidad extrema. El método está optimizado para catalogar perfiles extensos e imparciales de abundancia de proteínas de un patógeno dentro de condiciones que imitan infecciones. Específicamente, el método demostrado aquí proporciona información esencial sobre la patogénesis C. neoformans, como la producción de proteínas necesaria para la virulencia e identifica proteínas huésped críticas que responden a la invasión microbiana.
Introduction
La prevalencia de infecciones fúngicas invasivas está aumentando enormemente y está correlacionada con tasas de mortalidad inaceptablemente altas, más comúnmente notificadas en individuos con predisposiciones inmunodeficientes1. Cryptococcus neoformans es un famoso patógeno fúngico oportunista capaz de sobrevivir intracelularmente dentro de las células de macrófago huésped. La intervención antifúngica inadecuada da como resultado la difusión fúngica y manifestaciones potencialmente mortales de meningitis criptocócica y meningoencefalitis2,3. El aumento global del estatus inmunodeprimido ha exigido un aumento paralelo en el uso de agentes antifúngicos, en el que muchas especies fúngicas, incluyendo C. neoformans, han evolucionado cada vez más la resistencia hacia4,5,6. Por lo tanto, es imperativo implementar tecnologías sólidas y eficientes para responder a preguntas biológicas vitales con respecto a la respuesta de la defensa del huésped y la patogénesis microbiana.
La nueva era del avance tecnológico en espectrometría de masas (EM), incluida la generación de potentes tuberías computacionales y bioinformáticas, proporciona la base para una visión integrativa para el análisis a gran escala de la investigación de patógenos de host7,8. El análisis proteómico convencional impulsado por patógenos comúnmente perfila la vista de la infección desde la perspectiva del huésped o patógeno, incluyendo metodologías integrales tales como perfiles de correlación de proteínas, cromatografía de afinidad combinada con proteómica e interactómica9. Las investigaciones sobre la virulencia de patógenos peligrosos en un sistema huésped son de inmensa importancia clínica; sin embargo, la aplicación de un análisis de doble perspectiva en un solo experimento se consideraba antes inalcanzable. Por ejemplo, la perspectiva del patógeno hacia la infección a menudo se desborda por proteínas huésped altamente abundantes, lo que resulta en una sensibilidad reducida para la detección de proteínas fúngicas de baja abundancia7. Además, la alta complejidad de la muestra invita a muchos objetivos a investigar en un solo sistema experimental y resulta difícil de dilucidar los mecanismos de acción para una proteína patógena específica.
La proteómica ascendente es una técnica popular de EM que permite la preparación manejable de muestras, en la que los péptidos se generan mediante digestión enzimática específica de la secuencia seguida de separación, identificación y cuantificación de cromatografía líquida por MS10,11. Aquí, presentamos un método que demuestra una estrategia de adquisición dependiente de los datos con el propósito de lograr una cobertura imparcial de un proteoma o ‘infectoma’ basado en infecciones. En concreto, la cuantificación libre de etiquetas (LFQ) arroja la dependencia de las etiquetas químicas o metabólicas para una identificación robusta y precisa de los cambios en el nivel de proteínas en múltiples proteomas, reduciendo la manipulación y el procesamiento de muestraspasos 12,13. Esta aplicación universal interroga las proteínas producidas en un momento dado dentro de una célula independientemente de cualquier producción de proteína esperada; por lo tanto, se pueden descubrir nuevos conocimientos que son críticos para la infección.
El flujo de trabajo descrito aquí está optimizado para explorar los cambios en el nivel de proteínas de C. neoformans durante las condiciones de imitación de infecciones con células inmunes huésped (Figura 1). En lugar de basarse en el aislamiento y separación de los tipos celulares, este enfoque extrae el proteoma huésped y patógeno juntos, y utiliza la separación bioinformática utilizando dos bases de datos específicas del organismo para distinguir la producción de proteínas específicas de especies. Este método ofrece ventajas para un número ilimitado de muestras que se procesarán sin los costosos pasos de preparación necesarios en estudios de etiquetado o fraccionamiento basados en isótopos. Además, este flujo de trabajo admite protocolos optimizados de extracción de proteínas transferibles a una amplia gama de patógenos fúngicas y bacterianos capaces de atacar e infectar las células inmunes huésped. En general, este protocolo describe los pasos para completar una extracción de proteínas imparcial y procesamiento de muestras para EM de alta resolución, seguido de datos y análisis estadísticos, capaces de proporcionar una gran cantidad de conocimiento de proteínas fúngicas significativas para la infección combinadas con un perfil integral de la respuesta de defensa del huésped.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos en el protocolo incluyen la preparación de células de macrófago y la recolección de muestras de co-cultivo para el procesamiento de proteínas con una interrupción mínima de las células. Es importante realizar pasos de lavado, inoculación y eliminación de células de macrófago adherentes de forma suave y cuidadosa para evitar la lisis innecesaria de las células antes de la recolección. Establecer el MOI correcto para el experimento también es crítico, ya que la inoculación con un MOI ex…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Dr. Jonathan Krieger de Bioinformatics Solutions Inc. por operar el espectrómetro de masas para experimentos representativos, así como a los miembros del grupo Geddes-McAlister por su ayuda con la configuración experimental y la retroalimentación manuscrita. Los autores reconocen el apoyo a la financiación, en parte, de la Banting Research Foundation – The Jarislowsky Fellowship Discovery Award, New Frontiers Research Fund – Exploration (NFRFE-2019-00425), y la Canadian Foundation for Innovation (JELF 38798) para J.G.M., así como NSERC Canada Graduate Scholarship – Masters and Ontario Graduate Scholarship for B.B., y Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology for A.S..
Materials
| 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 | Fisher Scientific | BP152-1 | Maintain at 4°C |
| 60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 174888 | |
| 6-well cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Acetonitrile, MS grade | Pierce | TS-51101 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1099510001 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850-1L | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | ThermoFisher Scientific | A643-500 | Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month. |
| Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System | Fisher Scientific | 13-717-300 | Not essential, serological pipettes can be used to remove media. |
| C18 resin | 3M Empore | 3M2215 | |
| Cell Scrapers | VWR | 10062-906 | Not essential, other methods to release macrophage cells can be used. |
| Centrifugal vaccuum concentrator | Eppendorf | 07-748-15 | |
| Complete Filtration Unit | VWR | 10040-436 | |
| Conical falcon tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Not essential, haemocytometer can be used as an alternative. |
| CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation |
| Haemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| High-performance liquid chromatography system | ThermoFisher Scientific | LC140 | Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples. |
| High-resolution mass spectrometer | ThermoFisher Scientific | 726042 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I6125 | Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| LoBind Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 13-698-794 | |
| MaxQuant | https://maxquant.org/ | MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 13864457 | |
| Penicillin : Streptomycin 10k/10k | VWR | CA12001-692 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| Peptide separation columns | ThermoFisher Scientific | ES803 | |
| Perseus Software | http://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phosphate Buffered Saline | VWR | CA12001-676 | Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use. |
| Pierce BCA Protein Assay | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pipette, Disposable Serological (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix | Fisher Scientific | 14955235 | |
| Probe sonciator | ThermoFisher Scientific | 100-132-894 | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ThermoFisher Scientific | 28364 | 20% (w/v) |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| STAGE tipping centrifuge | Sonation | STC-V2 | |
| Thermal Shaker | VWR | NO89232-908 | |
| Trifluoroacetic acid | ThermoFisher Scientific | 85183 | |
| Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade | Pierce | A40007 | Maintain at -20 °C. |
| Ultrasonic bath | Bransonic | A89375-450 | Stored in cold room (4C) |
| Urea | Sigma Aldrich | U1250-1KG | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| Yeast-extract peptone dextrose broth | BD Difco | BM20 |
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