מודל עכברי לחקר התפקיד של פיברובלסטים הקשורים לסרטן בצמיחת הגידול

Summary

ניתן פרוטוקול להזרקה משותפת של תאים סרטניים ופיברובלסטים ולמעקב אחר צמיחת הגידול לאורך זמן. פרוטוקול זה יכול לשמש להבנת הבסיס המולקולרי לתפקידם של פיברובלסטים כמווסתים של צמיחת גידולים.

Abstract

פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) יכולים למלא תפקיד חשוב בצמיחת הגידול על ידי יצירת מיקרו-סביבה המקדמת גידולים. מודלים לחקר התפקיד של CAFs במיקרו-סביבה של הגידול יכולים להיות מועילים להבנת החשיבות התפקודית של פיברובלסטים, פיברובלסטים מרקמות שונות וגורמים גנטיים ספציפיים בפיברובלסטים. מודלים של עכברים חיוניים להבנת התורמים לצמיחת הגידול ולהתקדמות בהקשר in vivo. כאן, פרוטוקול שבו תאים סרטניים מעורבבים עם פיברובלסטים ומוכנסים לעכברים לפתח גידולים מסופקים. גודל הגידול לאורך זמן ומשקלי הגידול הסופיים נקבעים ומושווים בין קבוצות. הפרוטוקול המתואר יכול לספק תובנה נוספת לגבי התפקיד התפקודי של CAFs בגדילה ובהתקדמות של גידולים.

Introduction

בתוך המיקרו-סביבה של הגידול, אחד מסוגי התאים הבולטים ביותר הוא הפיברובלסט הקשור לסרטן (CAF)¹. פיברובלסטים אלה הקשורים לקרצינומה יכולים למלא תפקיד מדכא גידול ^2,3. לדוגמה, פיברובלסטים המבטאים S100A מפרישים קולגנים שיכולים לעטוף חומרים מסרטנים ולהגן מפני היווצרות קרצינומה⁴. יתר על כן, דלדול של שריר α חלק אקטין (SMA) חיובי myofibroblasts בסרטן הלבלב גורם לדיכוי חיסוני ומאיץ את התקדמות סרטן הלבלב². CAFs יכולים גם להתפתח יחד עם תאים סרטניים ולקדם את התקדמות הגידול 5,6,7,8. פיברובלסטים יכולים לסנתז ולהפריש חלבוני מטריצה חוץ-תאיים היוצרים סביבה מקדמת גידול⁸. חלבוני מטריצה חוץ-תאיים אלה יכולים לגרום להתקשות מכנית של הרקמה, אשר קשורה להתקדמות הגידול ^9,10. המטריצה החוץ-תאית השוקעת יכולה לשמש כמחסום פיזי המעכב חדירה חיסונית¹¹. שקיעת מטריקס על ידי CAFs נקשרה גם לפלישת גידולים מכיוון שפיברונקטין שנוצר על ידי CAFs הוכח כמקדם פלישה לגידול¹². CAFs מקדמים אנגיוגנזה ומגייסים תאים מדכאי חיסון למיקרו-סביבה של הגידול על ידי הפרשת גורם גדילה-β (TGF-β), גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF), אינטרלוקין-6 (IL-6) וליגנד CXC-כימוקין 12 (CXCL12)^13,14,15. בגלל תפקידם המרכזי בקידום צמיחת הגידול, פיברובלסטים הקשורים לסרטן הם יעד מתפתח לטיפול אנטי סרטני 6,16,17,18.

הפרוטוקול שלהלן מתאר שיטה לבדיקת האופן שבו פיברובלסטים משפיעים על צמיחת גידולים במודל עכברי מבוסס ונפוץ של צמיחת גידולים. על מנת להבין את חשיבותם של פיברובלסטים במיקרו-סביבה של הגידול, שונה הפרוטוקול הסטנדרטי להחדרת תאים סרטניים לעכברים כדי לעקוב אחר גדילתם כך שיכלול פיברובלסטים עם החדרת התאים הסרטניים. התאים הסרטניים יכולים להיות הציג תת עורית או intradermally. החדרה תוך עורית תגרום לגידולים הנובעים מהעור עצמו. Xenografts שבו תאים סרטניים ופיברובלסטים מוזרקים במשותף לעכברים מייצגים כלי מתודולוגי חשוב לניתוח התפקיד של פיברובלסטים, תת-אוכלוסיות של פיברובלסטים וגורמי חלבון ביכולת לקדם צמיחת סרטן 19,20,21. פרוטוקול מפורט להזרקה משותפת של תאים סרטניים ופיברובלסטים לעכברים מסופק. שיטה זו יכולה לשמש להשוואת נוכחות או היעדר פיברובלסטים, להשוואת פיברובלסטים ממקורות שונים²⁰, או להשוואת פיברובלסטים עם וללא ביטוי של חלבונים ספציפיים¹⁹. לאחר החדרת התאים הסרטניים והפיברובלסטים, ניתן לעקוב אחר גודל הגידול לאורך זמן. בתום הניסויים ניתן לנתח ולשקול גידולים. על ידי מעקב אחר צמיחת הגידול לאורך זמן, ניתן לנתח את חשיבותם של גורמים שונים.

ישנן גישות חלופיות אפשריות לחקר תפקידם של פיברובלסטים בצמיחת גידולים. לדוגמה, ישנם מודלים מבוססי Cre-loxed המספקים נוקאאוט ספציפי לרקמות של גנים עם מניעים המתבטאים באופן מועדף בפיברובלסטים. גישות כאלה מספקות גם הזדמנויות לחקור את תפקידם של גנים ומסלולים ספציפיים בפיברובלסטים להתקדמות הגידול. בהשוואה לגישות מבוססות Cre-lox, הפרוטוקול שסופק ייצג גישה מהירה יותר באופן משמעותי לניטור תפקידם של פיברובלסטים מכיוון שצמיחת הגידול תנוטר במשך מספר שבועות בלבד. הגישה המסופקת היא גם זולה משמעותית מכיוון שהיא אינה דורשת ייצור ושיכון מושבות של עכברים מהונדסים גנטית. הפרוטוקול המסופק יכול לשמש לבדיקה מהירה של ההשפעה של הפלת גנים שונים באמצעות shRNA במקום צורך לפתח מושבות עכברים. הגישה המסופקת היא גם גמישה יותר מכיוון שהיא תאפשר השוואה של מספרים שונים של פיברובלסטים, יחסים שונים של תאים סרטניים ופיברובלסטים, הפלת גנים שונים, ואפילו השוואה של פיברובלסטים מאתרי רקמות או מינים שונים. לגישת Cre-lox יהיה יתרון בכך שהפיברובלסטים נמצאים בתוך העכברים בהקשר פיזיולוגי יותר.

הפרוטוקול המדווח כאן יהיה בעל ערך עבור מדענים המבקשים לעקוב אחר ההשפעות של פיברובלסטים על צמיחת הגידול במהירות ובאופן חסכוני. פרוטוקול זה חשוב במיוחד עבור מדענים החוקרים תת-קבוצות שונות של פיברובלסטים או פיברובלסטים ממקורות שונים על צמיחת הגידול על צמיחת הגידול. אם חשוב שהתחלת הגידול תתרחש בהקשר פיזיולוגי, יש לשקול מודלים של עכברים מהונדסים גנטית.

ישנן מספר גישות אפשריות לביצוע ניסויים אלה. עכברים בעלי כשירות חיסונית יכולים לשמש כפונדקאים, מה שיאפשר חקירה של אינטראקציות פיברובלסטיות-חיסוניות בין תאים. עבור מודלים של עכברים בעלי כשירות חיסונית, יש להזריק תאי סרטן עכבר ופיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs). השימוש ב-MEFs גם מאפשר לחוקר לנצל את המגוון הרחב של זני עכברי נוקאאוט כדי לבדוק את נוכחותו או היעדרו של גן מעניין. לחלופין, ניתן להשתמש בעכברים עם חסר חיסוני כדי לבחון את תפקידם של פיברובלסטים אנושיים בקידום הצמיחה של גידולים בעכברים שמקורם בתאים סרטניים אנושיים. החדרת התאים הסרטניים יכולה להתבצע באופן תת עורי או אורתוטופי. עבור מלנומה, כפי שיתואר להלן, ניתן להזריק את תערובת הגידול-פיברובלסטים תוך עורית להזרקה אורתוטופית המדמה באופן הדוק יותר את המיקום בתוך העור שבו תתפתח מלנומה.

Protocol

כל הניסויים המתוארים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג’לס. הערה: בחר תאים סרטניים ופיברובלסטים המתאימים לעכברים המארחים עבור זן עכבר. בחר תאים סרטניים ופיברובלסטים המתאימים למין העכבר המארח. להשיג עכברים ממושבות רבייה או לרכוש אותם מספק?…

Representative Results

תאי מלנומה אנושיים A2058 ופיברובלסטים עוריים אנושיים ראשוניים גודלו בתרבית בתנאים סטריליים. התאים נאספו ונשטפו שלוש פעמים עם PBS. עכברים מדוכאי חיסון (NU/J – Foxn1 nude strain) הוזרקו תת עורית על צד אחד עם 0.25 מיליון תאי מלנומה A2058 בלבד. בצד השני הוזרקה לעכברים תערובת של 0.25 מיליון תאי מלנ…

Discussion

בניסוי באיור 1, החדרה משותפת של פיברובלסטים עוריים אנושיים עם תאי מלנומה אנושיים מסוג A2058 הביאה לגידולים גדולים יותר מאשר כאשר תאי המלנומה הוצגו ללא פיברובלסטים בהזרקה משותפת. הבדל זה יכול להיות מזוהה בקלות על סמך נפח הגידול ומשקל הגידול. התוצאות עולות בקנה אחד עם דיווחים ?…

Materials

26G Needles	Fisher Scientific	14-826-10
Alcohol swabs	Fisher Scientific	326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40	WAHL Professional	8787-450A
Athymic nude mice (NU/J)	The Jackson labs	002019	These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells	ATCC	ATCC® CRL-11147™	This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks	Fisher Scientific	14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g	Fisher Scientific	14-432-22
Countess Cell Counting Chamber	Fisher Scientific	C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	11965-118
Fetal bovine serum	Fisher Scientific	MT35010CV
Fibroblasts	ATCC	PCS-201-012	We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice	Fisher Scientific	50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet	Celltreat	667210B
Sterile 5 ml serological pipet	Celltreat	229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns	Fisher Scientific	09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	15400054
Sterile tissue-culture grade PBS	Fisher Scientific	50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet	Celltreat	667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes	Genesee Scientific	25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes	Genesee Scientific	25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes	Genesee Scientific	25-260
Trypan blue	Fisher Scientific	C10228