En musemodel til at undersøge rollen som kræftassocierede fibroblaster i tumorvækst

Summary

En protokol til co-injicere kræftceller og fibroblaster og overvåge tumorvækst over tid er tilvejebragt. Denne protokol kan bruges til at forstå det molekylære grundlag for fibroblasternes rolle som regulatorer af tumorvækst.

Abstract

Kræftassocierede fibroblaster (CAF’er) kan spille en vigtig rolle i tumorvækst ved at skabe et tumorfremmende mikromiljø. Modeller til at studere CAFs rolle i tumormikromiljøet kan være nyttige til at forstå den funktionelle betydning af fibroblaster, fibroblaster fra forskellige væv og specifikke genetiske faktorer i fibroblaster. Musemodeller er afgørende for at forstå bidragyderne til tumorvækst og progression i en in vivo-sammenhæng. Her tilvejebringes en protokol, hvor kræftceller blandes med fibroblaster og indføres i mus for at udvikle tumorer. Tumorstørrelser over tid og endelige tumorvægte bestemmes og sammenlignes mellem grupper. Den beskrevne protokol kan give mere indsigt i CAF’ernes funktionelle rolle i tumorvækst og progression.

Introduction

Inden for tumormikromiljøet er en af de mest fremtrædende celletyper den kræftassocierede fibroblast (CAF)¹. Disse carcinomassocierede fibroblaster kan spille en tumorundertrykkende rolle ^2,3. For eksempel udskiller S100A-ekspressive fibroblaster kollagener, der kan indkapsle kræftfremkaldende stoffer og beskytte mod dannelse af karcinom⁴. Endvidere forårsager udtømning af α-glat muskelactin (SMA)-positive myofibroblaster i kræft i bugspytkirtlen immunsuppression og fremskynder progression af kræft i bugspytkirtlen². CAF’er kan også udvikle sig sammen med kræftceller og fremme tumorprogression 5,6,7,8. Fibroblaster kan syntetisere og udskille ekstracellulære matrixproteiner, der skaber et tumorfremmende miljø⁸. Disse ekstracellulære matrixproteiner kan forårsage mekanisk afstivning af vævet, hvilket er forbundet med tumorprogression ^9,10. Den deponerede ekstracellulære matrix kan fungere som en fysisk barriere, der hæmmer immuninfiltration¹¹. Matrixaflejring af CAF’er har også været forbundet med tumorinvasion, da fibronectin genereret af CAF’er har vist sig at fremme tumorinvasion¹². CAF’er fremmer angiogenese og rekrutterer immunosuppressive celler til tumormikromiljøet ved at udskille transformerende vækstfaktor-β (TGF-β), vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF), interleukin-6 (IL-6) og CXC-kemokinligand 12 (CXCL12) ^13,14,15. På grund af deres centrale rolle i at fremme tumorvækst er kræftassocierede fibroblaster et voksende mål for kræftbehandling 6,16,17,18.

Protokollen nedenfor beskriver en metode til at teste, hvordan fibroblaster påvirker væksten af tumorer i en veletableret og udbredt musemodel for tumorvækst. For at forstå vigtigheden af fibroblaster i tumormikromiljøet blev standardprotokollen for introduktion af kræftceller i mus for at overvåge deres vækst ændret til at omfatte fibroblaster med kræftcelleintroduktionen. Kræftcellerne kan indføres subkutant eller intradermalt. Intradermal introduktion ville resultere i tumorer, der opstår fra selve huden. Xenotransplantater, hvor kræftceller og fibroblaster injiceres sammen i mus, repræsenterer et vigtigt metodologisk værktøj til at dissekere rollen som fibroblaster, subpopulationer af fibroblaster og proteinfaktorer i evnen til at fremme kræftvækst 19,20,21. En detaljeret protokol for samtidig injektion af kræftceller og fibroblaster i mus er tilvejebragt. Denne metode kan bruges til at sammenligne tilstedeværelsen eller fraværet af fibroblaster, til at sammenligne fibroblaster fra forskellige kilder²⁰ eller til at sammenligne fibroblaster med og uden ekspression af specifikke proteiner¹⁹. Efter kræftceller og fibroblaster er introduceret, tumor størrelse kan overvåges over tid. Ved afslutningen af forsøgene kan tumorer dissekeres og vejes. Ved at overvåge tumorvækst over tid kan betydningen af forskellige faktorer dissekeres.

Der er mulige alternative tilgange til at studere fibroblasternes rolle i tumorvækst. Som et eksempel er der Cre-loxed-baserede modeller, der giver mulighed for vævsspecifik knockout af gener med drivere udtrykt fortrinsvis i fibroblaster. Sådanne tilgange giver også muligheder for at undersøge rollen som specifikke gener og veje i fibroblaster til tumorprogression. Sammenlignet med Cre-lox-baserede tilgange ville den leverede protokol repræsentere en signifikant hurtigere tilgang til overvågning af fibroblasters rolle, fordi tumorvækst ville blive overvåget over blot et par uger. Den leverede tilgang er også betydeligt billigere, fordi den ikke kræver generering og opbevaring af kolonier af genetisk manipulerede mus. Den medfølgende protokol kan bruges til hurtigt at teste effekten af knockdown af forskellige gener ved hjælp af shRNA’er i stedet for at skulle udvikle musekolonier. Den leverede tilgang er også mere fleksibel, fordi den vil give mulighed for en sammenligning af forskellige antal fibroblaster, forskellige forhold mellem kræftceller og fibroblaster, knockdown af forskellige gener og endda sammenligning af fibroblaster fra forskellige vævssteder eller arter. En Cre-lox-tilgang ville have den fordel, at fibroblasterne er til stede i musene i en mere fysiologisk sammenhæng.

Protokollen rapporteret her ville være værdifuld for forskere, der søger at overvåge virkningerne af fibroblaster på tumorvækst hurtigt og omkostningseffektivt. Denne protokol er især værdifuld for forskere, der undersøger forskellige undergrupper af fibroblaster eller fibroblaster fra forskellige kilder på tumorvækst på tumorvækst. Hvis det er vigtigt, at tumorinitiering sker i en fysiologisk sammenhæng, bør genetisk manipulerede musemodeller overvejes.

Der er flere mulige tilgange til at udføre disse eksperimenter. Immunkompetente mus kan bruges som værter, hvilket ville muliggøre undersøgelse af fibroblast-immuncelleinteraktioner. For immunkompetente musemodeller skal musekræftceller og museembryonale fibroblaster (MEF’er) injiceres. Brugen af MEF’er giver også efterforskeren mulighed for at drage fordel af den brede vifte af knockout-musestammer til at teste tilstedeværelsen eller fraværet af et gen af interesse. Alternativt kan immun-mangelfulde mus bruges til at teste rollen som humane fibroblaster i at fremme væksten af tumorer i mus, der stammer fra humane kræftceller. Introduktion af kræftcellerne kan udføres subkutant eller ortopisk. For melanom, som beskrevet nedenfor, kan tumor-fibroblastblandingen injiceres intradermalt til ortopisk injektion, der nærmere simulerer det sted i huden, hvor et melanom ville udvikle sig.

Protocol

Alle beskrevne forsøg blev godkendt af Animal Care Committee ved University of California, Los Angeles. BEMÆRK: Vælg kræftceller og fibroblaster, der matcher værtsmusene for musestamme. Vælg kræftceller og fibroblaster, der matcher værtsmusens køn. Få mus fra avlskolonier eller køb dem fra velrenommerede leverandører. Indfør tumorer i mus, der er ~ 8-10 uger gamle. Mus med pels vil være i telogen eller hvilefasen af hårsækkecyklussen. Planlæg for et forhold på 0,5 til 3 fibro…

Representative Results

A2058 humane melanomceller og primære humane dermale fibroblaster blev dyrket under sterile forhold. Celler blev opsamlet og vasket tre gange med PBS. Immunodeficiente mus (NU/J – Foxn1 nøgen stamme) blev injiceret subkutant på den ene flanke med 0,25 millioner A2058 melanomceller alene. På den anden flanke blev mus injiceret med en blanding af 0,25 millioner A2058 melanomceller og 0,75 millioner fibroblaster. Celler blev injiceret i 12 immundefekte mus. Injektioner i venstre og højr…

Discussion

I eksperimentet i figur 1 resulterede samtidig introduktion af humane dermale fibroblaster med humane A2058 melanomceller i større tumorer, end når melanomcellerne blev introduceret uden co-injicerede fibroblaster. Denne forskel kunne let påvises baseret på tumorvolumen og tumorvægt. Resultaterne er i overensstemmelse med flere rapporter om, at kræftassocierede fibroblaster kan fremme tumorvækst 5,6,7,8.<sup class="…

Materials

26G Needles	Fisher Scientific	14-826-10
Alcohol swabs	Fisher Scientific	326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40	WAHL Professional	8787-450A
Athymic nude mice (NU/J)	The Jackson labs	002019	These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells	ATCC	ATCC® CRL-11147™	This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks	Fisher Scientific	14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g	Fisher Scientific	14-432-22
Countess Cell Counting Chamber	Fisher Scientific	C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	11965-118
Fetal bovine serum	Fisher Scientific	MT35010CV
Fibroblasts	ATCC	PCS-201-012	We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice	Fisher Scientific	50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet	Celltreat	667210B
Sterile 5 ml serological pipet	Celltreat	229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns	Fisher Scientific	09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	15400054
Sterile tissue-culture grade PBS	Fisher Scientific	50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet	Celltreat	667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes	Genesee Scientific	25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes	Genesee Scientific	25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes	Genesee Scientific	25-260
Trypan blue	Fisher Scientific	C10228