Un modello murino per studiare il ruolo dei fibroblasti associati al cancro nella crescita tumorale

Summary

Viene fornito un protocollo per co-iniettare cellule tumorali e fibroblasti e monitorare la crescita del tumore nel tempo. Questo protocollo può essere utilizzato per comprendere le basi molecolari del ruolo dei fibroblasti come regolatori della crescita tumorale.

Abstract

I fibroblasti associati al cancro (CAF) possono svolgere un ruolo importante nella crescita del tumore creando un microambiente che promuove il tumore. I modelli per studiare il ruolo dei CAF nel microambiente tumorale possono essere utili per comprendere l’importanza funzionale dei fibroblasti, dei fibroblasti di diversi tessuti e di specifici fattori genetici nei fibroblasti. I modelli murini sono essenziali per comprendere i fattori che contribuiscono alla crescita e alla progressione del tumore in un contesto in vivo. Qui, viene fornito un protocollo in cui le cellule tumorali vengono mescolate con fibroblasti e introdotte nei topi per sviluppare tumori. Le dimensioni del tumore nel tempo e i pesi finali del tumore sono determinati e confrontati tra i gruppi. Il protocollo descritto può fornire maggiori informazioni sul ruolo funzionale dei CAF nella crescita e nella progressione del tumore.

Introduction

All’interno del microambiente tumorale, uno dei tipi di cellule più importanti è il fibroblasto associato al cancro (CAF)¹. Questi fibroblasti associati al carcinoma possono svolgere un ruolo soppressivo del tumore ^2,3. Ad esempio, i fibroblasti che esprimono S100A secernono collageni che possono incapsulare agenti cancerogeni e proteggere dalla formazione di carcinoma⁴. Inoltre, l’esaurimento dei miofibroblasti positivi all’actina α-liscia (SMA) nel cancro del pancreas provoca immunosoppressione e accelera la progressione del cancro del pancreas². I CAF possono anche co-evolvere con le cellule tumorali e promuovere la progressione tumorale 5,6,7,8. I fibroblasti possono sintetizzare e secernere proteine della matrice extracellulare che creano un ambiente che promuove il tumore⁸. Queste proteine della matrice extracellulare possono causare irrigidimento meccanico del tessuto, che è associato alla progressione del tumore ^9,10. La matrice extracellulare depositata può agire come una barriera fisica che inibisce l’infiltrazione immunitaria¹¹. La deposizione di matrice da parte dei CAF è stata anche associata all’invasione tumorale poiché la fibronectina generata dai CAF ha dimostrato di promuovere l’invasione tumorale¹². I CAF promuovono l’angiogenesi e reclutano cellule immunosoppressive nel microambiente tumorale secernendo il fattore di crescita trasformante β (TGF-β), il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), l’interleuchina-6 (IL-6) e il ligando CXC-chemochine 12 (CXCL12) ^13,14,15. A causa del loro ruolo centrale nel promuovere la crescita tumorale, i fibroblasti associati al cancro sono un bersaglio emergente per la terapia anti-cancro 6,16,17,18.

Il protocollo seguente descrive un metodo per testare come i fibroblasti influenzano la crescita dei tumori in un modello murino di crescita tumorale ben consolidato e ampiamente utilizzato. Al fine di comprendere l’importanza dei fibroblasti nel microambiente tumorale, il protocollo standard per l’introduzione di cellule tumorali nei topi per monitorare la loro crescita è stato modificato per includere i fibroblasti con l’introduzione delle cellule tumorali. Le cellule tumorali possono essere introdotte per via sottocutanea o intradermica. L’introduzione intradermica provocherebbe tumori che derivano dalla pelle stessa. Gli xenotrapianti in cui cellule tumorali e fibroblasti vengono co-iniettati nei topi rappresentano un importante strumento metodologico per sezionare il ruolo dei fibroblasti, sottopopolazioni di fibroblasti e fattori proteici nella capacità di promuovere la crescita del cancro 19,20,21. Viene fornito un protocollo dettagliato per la co-iniezione di cellule tumorali e fibroblasti nei topi. Questo metodo può essere utilizzato per confrontare la presenza o l’assenza di fibroblasti, per confrontare fibroblasti provenienti da fonti diverse²⁰, o per confrontare fibroblasti con e senza espressione di proteine specifiche¹⁹. Dopo l’introduzione delle cellule tumorali e dei fibroblasti, la dimensione del tumore può essere monitorata nel tempo. Alla fine degli esperimenti, i tumori possono essere sezionati e pesati. Monitorando la crescita del tumore nel tempo, è possibile sezionare l’importanza di diversi fattori.

Esistono possibili approcci alternativi per studiare il ruolo dei fibroblasti nella crescita tumorale. Ad esempio, ci sono modelli basati su Cre-lox che prevedono il knockout tessuto-specifico di geni con driver espressi preferenzialmente nei fibroblasti. Tali approcci offrono anche l’opportunità di studiare il ruolo di geni e percorsi specifici nei fibroblasti per la progressione del tumore. Rispetto agli approcci basati su Cre-lox, il protocollo fornito rappresenterebbe un approccio significativamente più rapido al monitoraggio del ruolo dei fibroblasti perché la crescita del tumore verrebbe monitorata in poche settimane. L’approccio fornito è anche significativamente meno costoso perché non richiede la generazione e l’alloggiamento di colonie di topi geneticamente modificati. Il protocollo fornito può essere utilizzato per testare rapidamente l’effetto del knockdown di diversi geni utilizzando shRNA piuttosto che dover sviluppare colonie di topi. L’approccio fornito è anche più flessibile perché consentirebbe un confronto tra diversi numeri di fibroblasti, diversi rapporti di cellule tumorali e fibroblasti, abbattimento di geni diversi e persino confronto di fibroblasti da diversi siti o specie di tessuti. Un approccio Cre-lox avrebbe il vantaggio che i fibroblasti sono presenti all’interno dei topi in un contesto più fisiologico.

Il protocollo qui riportato sarebbe prezioso per gli scienziati che cercano di monitorare gli effetti dei fibroblasti sulla crescita del tumore in modo rapido ed economico. Questo protocollo è particolarmente prezioso per gli scienziati che studiano diversi sottoinsiemi di fibroblasti o fibroblasti da diverse fonti sulla crescita del tumore sulla crescita del tumore. Se è importante che l’inizio del tumore avvenga in un contesto fisiologico, dovrebbero essere presi in considerazione modelli murini geneticamente modificati.

Esistono diversi approcci possibili per eseguire questi esperimenti. I topi immunocompetenti possono essere utilizzati come ospiti, il che consentirebbe di studiare le interazioni fibroblasto-cellule immunitarie. Per i modelli murini immunocompetenti, devono essere iniettate cellule tumorali di topo e fibroblasti embrionali di topo (MEF). L’uso di MEF consente inoltre allo sperimentatore di sfruttare l’ampia gamma di ceppi murini knockout per testare la presenza o l’assenza di un gene di interesse. In alternativa, i topi immunodeficienti possono essere utilizzati per testare il ruolo dei fibroblasti umani nel promuovere la crescita dei tumori nei topi derivati da cellule tumorali umane. L’introduzione delle cellule tumorali può essere eseguita per via sottocutanea o ortotopica. Per il melanoma, come descritto di seguito, la miscela tumore-fibroblasto può essere iniettata per via intradermica per iniezione ortotopica che simula più da vicino la posizione all’interno della pelle in cui si svilupperebbe un melanoma.

Protocol

Tutti gli esperimenti descritti sono stati approvati dall’Animal Care Committee dell’Università della California, Los Angeles. NOTA: Selezionare le cellule tumorali e i fibroblasti che corrispondono ai topi ospiti per il ceppo di topo. Selezionare le cellule tumorali e i fibroblasti che corrispondono al sesso del topo ospite. Ottieni topi da colonie riproduttive o acquistali da fornitori affidabili. Introdurre tumori nei topi che sono ~ 8-10 settimane di età. I topi con pelliccia saranno nel…

Representative Results

A2058 cellule di melanoma umano e fibroblasti dermici umani primari sono stati coltivati in condizioni sterili. Le cellule sono state raccolte e lavate tre volte con PBS. Topi immunodeficienti (NU/J – ceppo nudo Foxn1) sono stati iniettati per via sottocutanea su un fianco con 0,25 milioni di cellule di melanoma A2058 da sole. Sull’altro lato, ai topi è stata iniettata una miscela di 0,25 milioni di cellule di melanoma A2058 e 0,75 milioni di fibroblasti. Le cellule sono state iniettate …

Discussion

Nell’esperimento nella Figura 1, la co-introduzione di fibroblasti dermici umani con cellule di melanoma umano A2058 ha provocato tumori più grandi rispetto a quando le cellule di melanoma sono state introdotte senza fibroblasti co-iniettati. Questa differenza potrebbe essere facilmente rilevata in base al volume del tumore e al peso del tumore. I risultati sono coerenti con molteplici segnalazioni che i fibroblasti associati al cancro possono promuovere la crescita …

Materials

26G Needles	Fisher Scientific	14-826-10
Alcohol swabs	Fisher Scientific	326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40	WAHL Professional	8787-450A
Athymic nude mice (NU/J)	The Jackson labs	002019	These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells	ATCC	ATCC® CRL-11147™	This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks	Fisher Scientific	14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g	Fisher Scientific	14-432-22
Countess Cell Counting Chamber	Fisher Scientific	C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	11965-118
Fetal bovine serum	Fisher Scientific	MT35010CV
Fibroblasts	ATCC	PCS-201-012	We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice	Fisher Scientific	50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet	Celltreat	667210B
Sterile 5 ml serological pipet	Celltreat	229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns	Fisher Scientific	09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	15400054
Sterile tissue-culture grade PBS	Fisher Scientific	50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet	Celltreat	667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes	Genesee Scientific	25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes	Genesee Scientific	25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes	Genesee Scientific	25-260
Trypan blue	Fisher Scientific	C10228