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Ricerca sul cancro

Um Modelo de Camundongo para Investigar o Papel de Fibroblastos Associados ao Câncer no Crescimento Tumoral

Published: December 22, 2020
doi:
10.3791/61883
, , , , , , , , , , , , , , , , ,
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology,University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine,University of California, Los Angeles, 3Department of Molecular Biology,Princeton University, 4Molecular Biology Institute,University of California, Los Angeles

Summary

Um protocolo para co-injetar células cancerosas e fibroblastos e monitorar o crescimento do tumor ao longo do tempo é fornecido. Este protocolo pode ser utilizado para entender as bases moleculares do papel dos fibroblastos como reguladores do crescimento tumoral.

Abstract

Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) podem desempenhar um papel importante no crescimento tumoral, criando um microambiente promotor de tumores. Modelos para estudar o papel das CAFs no microambiente tumoral podem ser úteis para a compreensão da importância funcional de fibroblastos, fibroblastos de diferentes tecidos e fatores genéticos específicos em fibroblastos. Modelos murinos são essenciais para a compreensão dos contribuintes para o crescimento e progressão tumoral em um contexto in vivo. Aqui, um protocolo em que células cancerosas são misturadas com fibroblastos e introduzidas em camundongos para desenvolver tumores é fornecido. O tamanho do tumor ao longo do tempo e o peso final do tumor são determinados e comparados entre os grupos. O protocolo descrito pode fornecer mais informações sobre o papel funcional das CAFs no crescimento e progressão tumoral.

Introduction

Dentro do microambiente tumoral, um dos tipos celulares mais proeminentes é o fibroblasto associado ao câncer (CAF)1. Esses fibroblastos associados ao carcinoma podem desempenhar um papel supressor dotumor2,3. Por exemplo, fibroblastos que expressam S100A secretam colágenos que podem encapsular carcinógenos e proteger contra a formação de carcinomas4. Além disso, a depleção de miofibroblastos positivos para actina de músculo liso α (AME) no câncer de pâncreas causa imunossupressão e acelera a progressão do câncer de pâncreas2. As CAFs também podem co-evoluir com células cancerosas e promover a progressão tumoral 5,6,7,8. Os fibroblastos podem sintetizar e secretar proteínas da matriz extracelular que criam um ambiente promotor detumores8. Essas proteínas da matriz extracelular podem causar enrijecimento mecânico do tecido, que está associado à progressãotumoral9,10. A matriz extracelular depositada pode atuar como uma barreira física que inibe a infiltraçãoimunológica11. A deposição de matriz por CAFs também tem sido associada à invasão tumoral, uma vez que foi demonstrado que a fibronectina gerada por CAFs promove invasão tumoral12. As CAFs promovem angiogênese e recrutam células imunossupressoras para o microambiente tumoral, secretando fator transformador de crescimento-β (TGF-β), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), interleucina-6 (IL-6) e CXC-quimiocina ligante 12 (CXCL12)13,14,15. Devido ao seu papel central na promoção do crescimento tumoral, os fibroblastos associados ao câncer são um alvo emergente para a terapia antineoplásica 6,16,17,18.

O protocolo abaixo descreve um método para testar como os fibroblastos afetam o crescimento de tumores em um modelo de crescimento tumoral em camundongos bem estabelecido e amplamente utilizado. A fim de compreender a importância dos fibroblastos no microambiente tumoral, o protocolo padrão para introdução de células cancerosas em camundongos para monitorar seu crescimento foi modificado para incluir fibroblastos com a introdução de células cancerosas. As células cancerosas podem ser introduzidas por via subcutânea ou intradérmica. A introdução intradérmica resultaria em tumores que surgem da própria pele. Xenoenxertos nos quais células cancerosas e fibroblastos são co-injetados em camundongos representam uma importante ferramenta metodológica para dissecar o papel de fibroblastos, subpopulações de fibroblastos e fatores proteicos na capacidade de promover o crescimento do câncer19,20,21. Um protocolo detalhado para co-injeção de células cancerosas e fibroblastos em camundongos é fornecido. Esse método pode ser utilizado para comparar a presença ou ausência de fibroblastos, para comparar fibroblastos de diferentes fontes20 ou para comparar fibroblastos com e sem expressão de proteínas específicas19. Depois que as células cancerosas e fibroblastos são introduzidos, o tamanho do tumor pode ser monitorado ao longo do tempo. Ao final dos experimentos, os tumores podem ser dissecados e pesados. Ao monitorar o crescimento tumoral ao longo do tempo, a importância de diferentes fatores pode ser dissecada.

Existem possíveis abordagens alternativas para estudar o papel dos fibroblastos no crescimento tumoral. Como exemplo, existem modelos baseados em Cre-loxed que fornecem nocaute tecido-específico de genes com drivers expressos preferencialmente em fibroblastos. Tais abordagens também oferecem oportunidades para investigar o papel de genes e vias específicas em fibroblastos para a progressão tumoral. Em comparação com as abordagens baseadas em Cre-lox, o protocolo fornecido representaria uma abordagem significativamente mais rápida para monitorar o papel dos fibroblastos, pois o crescimento do tumor seria monitorado por apenas algumas semanas. A abordagem fornecida também é significativamente menos dispendiosa porque não requer a geração e alojamento de colónias de ratinhos geneticamente modificados. O protocolo fornecido pode ser usado para testar rapidamente o efeito do knockdown de diferentes genes usando shRNAs em vez de precisar desenvolver colônias de camundongos. A abordagem fornecida também é mais flexível, pois permitiria a comparação de diferentes números de fibroblastos, diferentes proporções de células cancerosas e fibroblastos, knockdown de diferentes genes e até mesmo comparação de fibroblastos de diferentes sítios ou espécies de tecidos. Uma abordagem Cre-lox teria a vantagem de que os fibroblastos estão presentes dentro dos camundongos em um contexto mais fisiológico.

O protocolo aqui relatado seria valioso para os cientistas que procuram monitorar os efeitos dos fibroblastos no crescimento do tumor de forma rápida e econômica. Este protocolo é especialmente valioso para os cientistas que investigam diferentes subgrupos de fibroblastos ou fibroblastos de diferentes fontes sobre o crescimento do tumor no crescimento do tumor. Se é importante que a iniciação do tumor ocorra em um contexto fisiológico, então modelos de camundongos geneticamente modificados devem ser considerados.

Existem várias abordagens possíveis para a realização desses experimentos. Camundongos imunocompetentes podem ser usados como hospedeiros, o que permitiria a investigação de interações fibroblasto-imune celular. Para modelos de camundongos imunocompetentes, células cancerosas de camundongos e fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) devem ser injetados. O uso de MEFs também permite que o investigador aproveite a ampla gama de linhagens de camundongos knockout para testar a presença ou ausência de um gene de interesse. Alternativamente, camundongos imunodeficientes podem ser usados para testar o papel dos fibroblastos humanos na promoção do crescimento de tumores em camundongos que são derivados de células cancerosas humanas. A introdução das células cancerosas pode ser realizada por via subcutânea ou ortotópica. Para o melanoma, como descrito abaixo, a mistura tumor-fibroblasto pode ser injetada por via intradérmica para injeção ortotópica que simula mais de perto o local dentro da pele onde um melanoma se desenvolveria.

Protocol

Todos os experimentos descritos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade da Califórnia, Los Angeles. NOTA: Selecione células cancerosas e fibroblastos que correspondam aos camundongos hospedeiros para a cepa de camundongo. Selecione células cancerosas e fibroblastos que correspondam ao sexo do camundongo hospedeiro. Obter ratos de colônias de reprodução ou comprá-los de fornecedores respeitáveis. Introduzir tumores em ratos que são ~8-10 semanas de idade. C…

Representative Results

Células de melanoma humano A2058 e fibroblastos dérmicos humanos primários foram cultivados em condições estéreis. As células foram coletadas e lavadas três vezes com PBS. Camundongos imunodeficientes (NU/J – cepa Foxn1 nude) foram injetados por via subcutânea em um flanco com 0,25 milhão de células de melanoma A2058 isoladamente. No outro flanco, camundongos foram injetados com uma mistura de 0,25 milhão de células de melanoma A2058 e 0,75 milhão de fibroblastos. As célula…

Discussion

No experimento da Figura 1, a co-introdução de fibroblastos dérmicos humanos com células humanas de melanoma A2058 resultou em tumores maiores do que quando as células de melanoma foram introduzidas sem fibroblastos co-injetados. Essa diferença pode ser facilmente detectada com base no volume e peso tumoral. Os resultados são consistentes com múltiplos relatos de que fibroblastos associados ao câncer podem promover o crescimento tumoral5,6,7,8.<sup…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do laboratório Coller pela contribuição útil. H.A.C. foi o bolsista Milton E. Cassel da Fundação Rita Allen. Agradecemos ao NIH/NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, ao Prêmio de Ciência da Equipe da Aliança de Pesquisa de Melanoma, ao Prêmio do Programa de Integração de Laboratório Clínico do Instituto de Pesquisa do Câncer, ao Iris Cantor Women’s Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, ao Comitê Coordenador de Pesquisa do Câncer da Universidade da Califórnia, ao Prêmio Temático de Metabolismo da David Geffen School of Medicine, ao Clinical Translational Science Institute e ao Jonsson Comprehensive Cancer Center, Prêmios de Inovação do Centro de Pesquisa de Células-Tronco Amplas (Rose Hills e Ha Gaba), um Prêmio da UCLA SPORE em Câncer de Próstata (Instituto Nacional do Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Número de Prêmio P50CA092131), um Prêmio de Inovação do Centro de Células-Tronco Amplas, do Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research da UCLA, o Programa de Treinamento em Biologia Celular Tumoral (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), o Programa de Dermatologia T32 na UCLA AR071307 e o Programa de Treinamento em Biologia Celular Muscular, Fisiopatologia e Terapêutica T32 da UCLA 5 T32 AF 65972.

Materials

26G Needles Fisher Scientific 14-826-10
Alcohol swabs Fisher Scientific 326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 WAHL Professional 8787-450A
Athymic nude mice (NU/J) The Jackson labs 002019 These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells ATCC ATCC® CRL-11147™ This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks Fisher Scientific 14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g Fisher Scientific 14-432-22
Countess Cell Counting Chamber Fisher Scientific C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium Fisher Scientific 11965-118
Fetal bovine serum Fisher Scientific MT35010CV
Fibroblasts  ATCC PCS-201-012 We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane Henry Schein Animal Health NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice Fisher Scientific 50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet Celltreat 667210B
Sterile 5 ml serological pipet Celltreat 229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes Genesee Scientific 28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns Fisher Scientific 09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA Fisher Scientific 15400054
Sterile tissue-culture grade PBS Fisher Scientific 50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet Celltreat 667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes Genesee Scientific 25-260
Trypan blue Fisher Scientific C10228
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Jelinek, D., Zhang, E. R., Ambrus, A., Haley, E., Guinn, E., Vo, A., Le, P., Kesaf, A. E., Nguyen, J., Guo, L., Frederick, D., Sun, Z., Guo, N., Sevier, P., Bilotta, E., Atai, K., Voisin, L., Coller, H. A. A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth. J. Vis. Exp. (166), e61883, doi:10.3791/61883 (2020).
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