JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Ricerca sul cancro

Мышиная модель для исследования роли связанных с раком фибробластов в росте опухоли

Published: December 22, 2020
doi:
10.3791/61883
, , , , , , , , , , , , , , , , ,
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology,University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine,University of California, Los Angeles, 3Department of Molecular Biology,Princeton University, 4Molecular Biology Institute,University of California, Los Angeles

Summary

Предусмотрен протокол для совместного введения раковых клеток и фибробластов и мониторинга роста опухоли с течением времени. Этот протокол может быть использован для понимания молекулярной основы роли фибробластов как регуляторов роста опухоли.

Abstract

Ассоциированные с раком фибробласты (CAF) могут играть важную роль в росте опухоли, создавая микроокружение, способствующее развитию опухоли. Модели для изучения роли CAF в микроокружении опухоли могут быть полезны для понимания функциональной важности фибробластов, фибробластов из разных тканей и специфических генетических факторов в фибробластах. Мышиные модели необходимы для понимания факторов, способствующих росту и прогрессированию опухоли в контексте in vivo. Здесь предусмотрен протокол, в котором раковые клетки смешиваются с фибробластами и вводятся мышам для развития опухолей. Размеры опухоли с течением времени и конечная масса опухоли определяются и сравниваются между группами. Описанный протокол может дать более полное представление о функциональной роли CAF в росте и прогрессировании опухоли.

Introduction

В микроокружении опухоли одним из наиболее заметных типов клеток является связанный с раком фибробласт (CAF)1. Эти фибробласты, связанные с карциномой, могут играть опухолевую роль 2,3. Например, фибробласты, экспрессирующие S100A, секретируют коллагены, которые могут инкапсулировать канцерогены и защищать от образования карциномы4. Кроме того, истощение α-гладкомышечного актина (СМА)-положительных миофибробластов при раке поджелудочной железы вызывает иммуносупрессию и ускоряет прогрессирование рака поджелудочной железы2. CAF также могут развиваться совместно с раковыми клетками и способствовать прогрессированию опухоли 5,6,7,8. Фибробласты могут синтезировать и секретировать белки внеклеточного матрикса, которые создают среду, способствующую развитию опухоли8. Эти белки внеклеточного матрикса могут вызывать механическую жесткость ткани, что связано с прогрессированием опухоли 9,10. Депонированный внеклеточный матрикс может действовать как физический барьер, который ингибирует иммунную инфильтрацию11. Матричное осаждение CAF также было связано с инвазией опухоли, поскольку было показано, что фибронектин, генерируемый CAF, способствует инвазииопухоли 12. CAF способствуют ангиогенезу и рекрутируют иммуносупрессивные клетки в микроокружение опухоли, секретируя трансформирующий фактор роста-β (TGF-β), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), интерлейкин-6 (IL-6) и CXC-хемокиновый лиганд 12 (CXCL12)13,14,15. Из-за их центральной роли в стимулировании роста опухоли фибробласты, связанные с раком, являются новой мишенью для противораковой терапии 6,16,17,18.

В приведенном ниже протоколе описывается метод проверки того, как фибробласты влияют на рост опухолей в хорошо зарекомендовавшей себя и широко используемой мышиной модели роста опухоли. Чтобы понять важность фибробластов в микроокружении опухоли, стандартный протокол введения раковых клеток мышам для мониторинга их роста был изменен, чтобы включить фибробласты с введением раковых клеток. Раковые клетки могут быть введены подкожно или внутрикожно. Внутрикожное введение приведет к опухолям, которые возникают из самой кожи. Ксенотрансплантаты, в которых раковые клетки и фибробласты совместно вводят мышам, представляют собой важный методологический инструмент для анализа роли фибробластов, субпопуляций фибробластов и белковых факторов в способности стимулировать рост рака 19,20,21. Приведен подробный протокол совместной инъекции раковых клеток и фибробластов мышам. Этот метод может быть использован для сравнения наличия или отсутствия фибробластов, для сравнения фибробластов из разных источников20 или для сравнения фибробластов с экспрессией специфических белков19 и без нее. После введения раковых клеток и фибробластов размер опухоли можно контролировать с течением времени. По окончании экспериментов опухоли могут быть препарированы и взвешены. Наблюдая за ростом опухоли с течением времени, можно проанализировать важность различных факторов.

Возможны альтернативные подходы к изучению роли фибробластов в опухолевом росте. В качестве примера можно привести модели на основе Cre-loxed, которые обеспечивают тканеспецифический нокаут генов с драйверами, экспрессируемыми преимущественно в фибробластах. Такие подходы также дают возможность исследовать роль специфических генов и путей в фибробластах для прогрессирования опухоли. По сравнению с подходами, основанными на крелоксе, представленный протокол будет представлять собой значительно более быстрый подход к мониторингу роли фибробластов, поскольку рост опухоли будет контролироваться всего за несколько недель. Предлагаемый подход также значительно дешевле, поскольку он не требует создания и размещения колоний генетически модифицированных мышей. Предоставленный протокол может быть использован для быстрого тестирования эффекта нокдауна различных генов с использованием шРНК вместо необходимости развития колоний мышей. Представленный подход также является более гибким, поскольку он позволяет сравнивать различное количество фибробластов, различные соотношения раковых клеток и фибробластов, нокдаун разных генов и даже сравнение фибробластов из разных участков ткани или видов. Подход Cre-lox будет иметь то преимущество, что фибробласты присутствуют у мышей в более физиологическом контексте.

Протокол, представленный здесь, будет полезен для ученых, которые стремятся быстро и экономически эффективно отслеживать влияние фибробластов на рост опухоли. Этот протокол особенно ценен для ученых, исследующих различные подмножества фибробластов или фибробластов из разных источников по росту опухоли по росту опухоли. Если важно, чтобы инициация опухоли происходила в физиологическом контексте, то следует рассмотреть генно-инженерные модели мышей.

Существует несколько возможных подходов к проведению этих экспериментов. Иммунокомпетентные мыши могут быть использованы в качестве хозяев, что позволит исследовать взаимодействие фибробластов и иммунных клеток. Для иммунокомпетентных моделей мышей необходимо вводить раковые клетки мыши и эмбриональные фибробласты мыши (MEF). Использование MEF также позволяет исследователю использовать широкий спектр нокаутных штаммов мышей для проверки наличия или отсутствия интересующего гена. В качестве альтернативы, мыши с иммунодефицитом могут быть использованы для проверки роли человеческих фибробластов в стимулировании роста опухолей у мышей, которые происходят из раковых клеток человека. Введение раковых клеток может быть выполнено подкожно или ортотопически. Для меланомы, как описано ниже, смесь опухоли и фибробластов может быть введена внутрикожно для ортотопической инъекции, которая более точно имитирует место в коже, где будет развиваться меланома.

Protocol

Все описанные эксперименты были одобрены Комитетом по уходу за животными Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе. ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите раковые клетки и фибробласты, которые соответствуют мышам-хозяевам для мышиного штамма. Выберите раковые клетки и фибробласты, к…

Representative Results

Клетки меланомы человека A2058 и первичные дермальные фибробласты человека культивировали в стерильных условиях. Клетки собирали и трижды промывали ПБС. Мышам с иммунодефицитом (штамм NU/J – Foxn1 nude) вводили подкожно на один фланг только 0,25 миллиона клеток меланомы A2058. На д?…

Discussion

В эксперименте, показанном на рисунке 1, одновременное введение дермальных фибробластов человека с клетками меланомы человека A2058 привело к более крупным опухолям, чем когда клетки меланомы были введены без совместно введенных фибробластов. Эта разница может быть легк?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы выражают благодарность всем сотрудникам лаборатории Коллера за полезный вклад. H.A.C. был стипендиатом Милтона Э. Касселя из Фонда Риты Аллен. Мы признаем NIH / NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, Научную премию Альянса по исследованию меланомы, Награду за программу интеграции клинических лабораторий Института исследований рака, Центр женского здоровья Айрис Кантор / Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе Грант CTSI NIH UL1TR000124, Координационный комитет по исследованию рака Калифорнийского университета, Тематическая премия Медицинской школы Дэвида Геффена за метаболизм, Институт клинических трансляционных наук и Комплексный онкологический центр Йонссона, Награды за инновации от Исследовательского центра широких стволовых клеток (Роуз-Хиллз и Ха-Габа), награда от Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе SPORE в области рака предстательной железы (Национальный институт рака Национальных институтов здравоохранения под номером P50CA092131), награда за инновации от Центра широких стволовых клеток, Центра регенеративной медицины и исследований стволовых клеток Эли и Эдит Броуд в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе, Учебная программа по биологии опухолевых клеток (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), программа дерматологии T32 в UCLA AR071307 и Программа обучения биологии, патофизиологии и терапии мышечных клеток Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе T32 5 T32 AF 65972.

Materials

26G Needles Fisher Scientific 14-826-10
Alcohol swabs Fisher Scientific 326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 WAHL Professional 8787-450A
Athymic nude mice (NU/J) The Jackson labs 002019 These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells ATCC ATCC® CRL-11147™ This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks Fisher Scientific 14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g Fisher Scientific 14-432-22
Countess Cell Counting Chamber Fisher Scientific C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium Fisher Scientific 11965-118
Fetal bovine serum Fisher Scientific MT35010CV
Fibroblasts  ATCC PCS-201-012 We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane Henry Schein Animal Health NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice Fisher Scientific 50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet Celltreat 667210B
Sterile 5 ml serological pipet Celltreat 229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes Genesee Scientific 28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns Fisher Scientific 09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA Fisher Scientific 15400054
Sterile tissue-culture grade PBS Fisher Scientific 50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet Celltreat 667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes Genesee Scientific 25-260
Trypan blue Fisher Scientific C10228
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Liu, T., et al. Cancer-associated fibroblasts: an emerging target of anti-cancer immunotherapy. Journal of Hematology and Oncololgy. 12 (1), 86 (2019).
  2. Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25 (6), 719-734 (2014).
  3. Rhim, A. D., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 25 (6), 735-747 (2014).
  4. Zhang, J., et al. Fibroblast-specific protein 1/S100A4-positive cells prevent carcinoma through collagen production and encapsulation of carcinogens. Ricerca sul cancro. 73 (9), 2770-2781 (2013).
  5. Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1503-1523 (2014).
  6. Chen, X., Song, E. Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).
  7. Wang, W., et al. Crosstalk to stromal fibroblasts induces resistance of lung cancer to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors. Clinical Cancer Research. 15 (21), 6630-6638 (2009).
  8. Hwang, R. F., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Ricerca sul cancro. 68 (3), 918-926 (2008).
  9. Tsujino, T., et al. Stromal myofibroblasts predict disease recurrence for colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 13 (7), 2082-2090 (2007).
  10. Laklai, H., et al. Genotype tunes pancreatic ductal adenocarcinoma tissue tension to induce matricellular fibrosis and tumor progression. Nature Medicine. 22 (5), 497-505 (2016).
  11. Cukierman, E., Bassi, D. E. Physico-mechanical aspects of extracellular matrix influences on tumorigenic behaviors. Seminars in Cancer Biology. 20 (3), 139-145 (2010).
  12. Attieh, Y., et al. Cancer-associated fibroblasts lead tumor invasion through integrin-beta3-dependent fibronectin assembly. Journal of Cell Biology. 216 (11), 3509-3520 (2017).
  13. Ahmadzadeh, M., Rosenberg, S. A. TGF-beta 1 attenuates the acquisition and expression of effector function by tumor antigen-specific human memory CD8 T cells. Journal of Immunology. 174 (9), 5215-5223 (2005).
  14. Feig, C., et al. Targeting CXCL12 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti-PD-L1 immunotherapy in pancreatic cancer. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 110 (50), 20212-20217 (2013).
  15. Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
  16. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
  17. Ziani, L., Chouaib, S., Thiery, J. Alteration of the Antitumor Immune Response by Cancer-Associated Fibroblasts. Frontiers in Immunology. 9, 414 (2018).
  18. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  19. Grum-Schwensen, B., et al. Suppression of tumor development and metastasis formation in mice lacking the S100A4(mts1) gene. Ricerca sul cancro. 65 (9), 3772-3780 (2005).
  20. Kojima, M., et al. Human subperitoneal fibroblast and cancer cell interaction creates microenvironment that enhances tumor progression and metastasis. PLoS One. 9 (2), 88018 (2014).
  21. Noel, A., et al. Enhancement of tumorigenicity of human breast adenocarcinoma cells in nude mice by matrigel and fibroblasts. British Journal of Cancer. 68 (5), 909-915 (1993).
  22. Sullivan, L. M. Estimation from samples. Circulation. 114 (5), 445-449 (2006).
  23. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  24. Damianova, R., Stefanova, N., Cukierman, E., Momchilova, A., Pankov, R. Three-dimensional matrix induces sustained activation of ERK1/2 via Src/Ras/Raf signaling pathway. Cell Biology International. 32 (2), 229-234 (2008).
  25. Rhee, S. Fibroblasts in three dimensional matrices: cell migration and matrix remodeling. Experimental & Molecular Medicine. 41 (12), 858-865 (2009).
  26. Hoffman, R. M. Application of GFP imaging in cancer. Labortatory Investigation. 95 (4), 432-452 (2015).
  27. Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
  28. Naito, Y., et al. CD8+ T cells infiltrated within cancer cell nests as a prognostic factor in human colorectal cancer. Ricerca sul cancro. 58 (16), 3491-3494 (1998).
  29. Fu, C., Jiang, A. Dendritic Cells and CD8 T Cell Immunity in Tumor Microenvironment. Frontiers Immunolofy. 9, 3059 (2018).
  30. Lakins, M. A., Ghorani, E., Munir, H., Martins, C. P., Shields, J. D. Cancer-associated fibroblasts induce antigen-specific deletion of CD8 (+) T Cells to protect tumour cells. Nature Communications. 9 (1), 948 (2018).
  31. Kato, T., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Affect Intratumoral CD8(+) and FoxP3(+) T Cells Via IL6 in the Tumor Microenvironment. Clinical Cancer Research. 24 (19), 4820-4833 (2018).
  32. Gorchs, L., et al. Human Pancreatic Carcinoma-Associated Fibroblasts Promote Expression of Co-inhibitory Markers on CD4(+) and CD8(+) T-Cells. Frontiers Immunology. 10, 847 (2019).
  33. Duscher, D., et al. Fibroblast-Specific Deletion of Hypoxia Inducible Factor-1 Critically Impairs Murine Cutaneous Neovascularization and Wound Healing. Plastic Reconstructive Surgery. 136 (5), 1004-1013 (2015).
  34. Zheng, B., Zhang, Z., Black, C. M., de Crombrugghe, B., Denton, C. P. Ligand-dependent genetic recombination in fibroblasts : a potentially powerful technique for investigating gene function in fibrosis. American Journal of Pathology. 160 (5), 1609-1617 (2002).
  35. Swonger, J. M., Liu, J. S., Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Genetic tools for identifying and manipulating fibroblasts in the mouse. Differentiation. 92 (3), 66-83 (2016).
  36. Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
  37. Ortiz-Montero, P., Londono-Vallejo, A., Vernot, J. P. Senescence-associated IL-6 and IL-8 cytokines induce a self- and cross-reinforced senescence/inflammatory milieu strengthening tumorigenic capabilities in the MCF-7 breast cancer cell line. Cell Communication and Signaling. 15 (1), 17 (2017).
  38. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  39. Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biolofy. 4 (3), 83 (2006).
  40. Mitra, M., et al. Alternative polyadenylation factors link cell cycle to migration. Genome Biolofy. 19 (1), 176 (2018).
  41. Lemons, J. M., et al. Quiescent fibroblasts exhibit high metabolic activity. PLoS Biology. 8 (10), 1000514 (2010).
  42. Suh, E. J., et al. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biology. 13 (12), 121 (2012).
  43. Legesse-Miller, A., et al. Quiescent fibroblasts are protected from proteasome inhibition-mediated toxicity. Molecular Biology of the Cell. 23 (18), 3566-3581 (2012).
  44. Evertts, A. G., et al. H4K20 methylation regulates quiescence and chromatin compaction. Molecular Biology of the Cell. 24 (19), 3025-3037 (2013).
  45. Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
  46. Marinkovic, A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Matrices of physiologic stiffness potently inactivate idiopathic pulmonary fibrosis fibroblasts. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 422-430 (2013).
  47. Tschumperlin, D. J. Fibroblasts and the ground they walk on. Physiology (Bethesda). 28 (6), 380-390 (2013).
  48. Tschumperlin, D. J., et al. Mechanotransduction through growth-factor shedding into the extracellular space. Nature. 429 (6987), 83-86 (2004).
  49. Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
  50. Alexander, J., Cukierman, E. Stromal dynamic reciprocity in cancer: intricacies of fibroblastic-ECM interactions. Current Opinions in Cell Biology. 42, 80-93 (2016).

Tags

Keywords: Cancer-associated FibroblastsTumor GrowthMelanomaMouse ModelCell CultureTrypsin-EDTAHemocytometerCell Counting
check_url/it/61883?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Jelinek, D., Zhang, E. R., Ambrus, A., Haley, E., Guinn, E., Vo, A., Le, P., Kesaf, A. E., Nguyen, J., Guo, L., Frederick, D., Sun, Z., Guo, N., Sevier, P., Bilotta, E., Atai, K., Voisin, L., Coller, H. A. A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth. J. Vis. Exp. (166), e61883, doi:10.3791/61883 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image