En musmodell för att undersöka rollen av cancerassocierade fibroblaster i tumörtillväxt

Summary

Ett protokoll för att saminjicera cancerceller och fibroblaster och övervaka tumörtillväxt över tid tillhandahålls. Detta protokoll kan användas för att förstå den molekylära grunden för fibroblasternas roll som regulatorer för tumörtillväxt.

Abstract

Cancerassocierade fibroblaster (CAF) kan spela en viktig roll i tumörtillväxt genom att skapa en tumörfrämjande mikromiljö. Modeller för att studera CAF: s roll i tumörmikromiljön kan vara till hjälp för att förstå den funktionella betydelsen av fibroblaster, fibroblaster från olika vävnader och specifika genetiska faktorer i fibroblaster. Musmodeller är viktiga för att förstå bidragsgivarna till tumörtillväxt och progression i ett in vivo-sammanhang. Här tillhandahålls ett protokoll där cancerceller blandas med fibroblaster och införs i möss för att utveckla tumörer. Tumörstorlekar över tid och slutliga tumörvikter bestäms och jämförs mellan grupper. Det beskrivna protokollet kan ge mer insikt i CAF: s funktionella roll i tumörtillväxt och progression.

Introduction

Inom tumörmikromiljön är en av de mest framträdande celltyperna den cancerassocierade fibroblasten (CAF)¹. Dessa karcinomassocierade fibroblaster kan spela en tumörsuppressiv roll ^2,3. Till exempel utsöndrar S100A-uttryckande fibroblaster kollagener som kan kapsla in cancerframkallande ämnen och skydda mot karcinombildning⁴. Vidare orsakar utarmning av α-glattmuskelaktin (SMA)-positiva myofibroblaster i bukspottkörtelcancer immunsuppression och påskyndar bukspottkörtelcancerprogression². CAF kan också utvecklas tillsammans med cancerceller och främja tumörprogression 5,6,7,8. Fibroblaster kan syntetisera och utsöndra extracellulära matrisproteiner som skapar en tumörfrämjande miljö⁸. Dessa extracellulära matrixproteiner kan orsaka mekanisk förstyvning av vävnaden, vilket är associerat med tumörprogression ^9,10. Den deponerade extracellulära matrisen kan fungera som en fysisk barriär som hämmar immuninfiltration¹¹. Matrisdeponering av CAF har också associerats med tumörinvasion eftersom fibronektin genererat av CAF har visat sig främja tumörinvasion¹². CAF främjar angiogenes och rekryterar immunsuppressiva celler till tumörmikromiljön genom att utsöndra transformerande tillväxtfaktor-β (TGF-β), vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), interleukin-6 (IL-6) och CXC-kemokinligand 12 (CXCL12)^13,14,15. På grund av deras centrala roll för att främja tumörtillväxt är cancerassocierade fibroblaster ett framväxande mål för anti-cancerbehandling 6,16,17,18.

Protokollet nedan beskriver en metod för att testa hur fibroblaster påverkar tillväxten av tumörer i en väletablerad och allmänt använd musmodell av tumörtillväxt. För att förstå betydelsen av fibroblaster i tumörmikromiljön modifierades standardprotokollet för införande av cancerceller i möss för att övervaka deras tillväxt för att inkludera fibroblaster med cancercellsintroduktionen. Cancercellerna kan introduceras subkutant eller intradermalt. Intradermal introduktion skulle resultera i tumörer som uppstår från själva huden. Xenotransplantat där cancerceller och fibroblaster saminjiceras i möss utgör ett viktigt metodiskt verktyg för att dissekera fibroblasternas roll, subpopulationer av fibroblaster och proteinfaktorer i förmågan att främja cancertillväxt 19,20,21. Ett detaljerat protokoll för samtidig injektion av cancerceller och fibroblaster i möss tillhandahålls. Denna metod kan användas för att jämföra förekomst eller frånvaro av fibroblaster, för att jämföra fibroblaster från olika källor²⁰ eller för att jämföra fibroblaster med och utan uttryck av specifika proteiner¹⁹. Efter cancerceller och fibroblaster introduceras, tumörstorlek kan övervakas över tiden. I slutet av experimenten kan tumörer dissekeras och vägas. Genom att övervaka tumörtillväxt över tid kan betydelsen av olika faktorer dissekeras.

Det finns möjliga alternativa metoder för att studera fibroblasternas roll i tumörtillväxt. Som ett exempel finns det Cre-loxed-baserade modeller som tillhandahåller vävnadsspecifik knockout av gener med drivrutiner som uttrycks företrädesvis i fibroblaster. Sådana tillvägagångssätt ger också möjligheter att undersöka rollen av specifika gener och vägar i fibroblaster för tumörprogression. Jämfört med Cre-lox-baserade tillvägagångssätt skulle det tillhandahållna protokollet representera ett betydligt snabbare tillvägagångssätt för att övervaka fibroblasternas roll eftersom tumörtillväxt skulle övervakas under bara några veckor. Det tillhandahållna tillvägagångssättet är också betydligt billigare eftersom det inte kräver generering och hysning av kolonier av genetiskt modifierade möss. Det tillhandahållna protokollet kan användas för att snabbt testa effekten av knockdown av olika gener med hjälp av shRNA snarare än att behöva utveckla muskolonier. Det tillhandahållna tillvägagångssättet är också mer flexibelt eftersom det skulle möjliggöra en jämförelse av olika antal fibroblaster, olika förhållanden mellan cancerceller och fibroblaster, knockdown av olika gener och till och med jämförelse av fibroblaster från olika vävnadsställen eller arter. Ett Cre-lox-tillvägagångssätt skulle ha fördelen att fibroblasterna finns i mössen i ett mer fysiologiskt sammanhang.

Protokollet som rapporteras här skulle vara värdefullt för forskare som försöker övervaka effekterna av fibroblaster på tumörtillväxt snabbt och kostnadseffektivt. Detta protokoll är särskilt värdefullt för forskare som undersöker olika undergrupper av fibroblaster eller fibroblaster från olika källor på tumörtillväxt på tumörtillväxt. Om det är viktigt att tumörinitiering sker i ett fysiologiskt sammanhang, bör genetiskt modifierade musmodeller övervägas.

Det finns flera möjliga metoder för att utföra dessa experiment. Immunkompetenta möss kan användas som värdar, vilket skulle möjliggöra undersökning av fibroblast-immuncellsinteraktioner. För immunkompetenta musmodeller måste muscancerceller och embryonala fibroblaster (MEF) injiceras. Användningen av MEF gör det också möjligt för utredaren att dra nytta av det stora utbudet av knockout-musstammar för att testa närvaron eller frånvaron av en gen av intresse. Alternativt kan immunbristande möss användas för att testa rollen som humana fibroblaster för att främja tillväxten av tumörer hos möss som härrör från mänskliga cancerceller. Införandet av cancercellerna kan utföras subkutant eller ortotopiskt. För melanom, som beskrivs nedan, kan tumör-fibroblastblandningen injiceras intradermalt för ortotopisk injektion som närmare simulerar den plats i huden där ett melanom skulle utvecklas.

Protocol

Alla beskrivna experiment godkändes av djurvårdskommittén vid University of California, Los Angeles. OBS: Välj cancerceller och fibroblaster som matchar värdmössen för musstam. Välj cancerceller och fibroblaster som matchar värdmusens kön. Skaffa möss från avelskolonier eller köp dem från välrenommerade leverantörer. Introducera tumörer i möss som är ~ 8-10 veckors ålder. Möss med päls kommer att vara i telogen- eller vilofas av hårsäckcykeln. Planera för ett förhåll…

Representative Results

A2058 humana melanomceller och primära humana dermala fibroblaster odlades under sterila förhållanden. Celler samlades in och tvättades tre gånger med PBS. Immunbristfälliga möss (NU/J – Foxn1 naken stam) injicerades subkutant på en flank med 0,25 miljoner A2058 melanomceller ensamma. På den andra flanken injicerades möss med en blandning av 0,25 miljoner A2058 melanomceller och 0,75 miljoner fibroblaster. Celler injicerades i 12 möss med immunbrist. Injektioner i vänster och …

Discussion

I experimentet i figur 1 resulterade samtidig introduktion av humana dermala fibroblaster med humana A2058-melanomceller i större tumörer än när melanomcellerna introducerades utan saminjicerade fibroblaster. Denna skillnad kan lätt detekteras baserat på tumörvolym och tumörvikt. Resultaten överensstämmer med flera rapporter om att cancerassocierade fibroblaster kan främja tumörtillväxt 5,6,7,8.<sup class="xre…

Materials

26G Needles	Fisher Scientific	14-826-10
Alcohol swabs	Fisher Scientific	326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40	WAHL Professional	8787-450A
Athymic nude mice (NU/J)	The Jackson labs	002019	These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells	ATCC	ATCC® CRL-11147™	This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks	Fisher Scientific	14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g	Fisher Scientific	14-432-22
Countess Cell Counting Chamber	Fisher Scientific	C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	11965-118
Fetal bovine serum	Fisher Scientific	MT35010CV
Fibroblasts	ATCC	PCS-201-012	We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice	Fisher Scientific	50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet	Celltreat	667210B
Sterile 5 ml serological pipet	Celltreat	229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns	Fisher Scientific	09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	15400054
Sterile tissue-culture grade PBS	Fisher Scientific	50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet	Celltreat	667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes	Genesee Scientific	25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes	Genesee Scientific	25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes	Genesee Scientific	25-260
Trypan blue	Fisher Scientific	C10228