Un modelo de ratón para investigar el papel de los fibroblastos asociados al cáncer en el crecimiento tumoral
Summary
Se proporciona un protocolo para coinyectar células cancerosas y fibroblastos y monitorear el crecimiento tumoral a lo largo del tiempo. Este protocolo se puede utilizar para comprender las bases moleculares del papel de los fibroblastos como reguladores del crecimiento tumoral.
Abstract
Los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) pueden desempeñar un papel importante en el crecimiento tumoral al crear un microambiente promotor de tumores. Los modelos para estudiar el papel de los CAF en el microambiente tumoral pueden ser útiles para comprender la importancia funcional de los fibroblastos, los fibroblastos de diferentes tejidos y los factores genéticos específicos en los fibroblastos. Los modelos de ratón son esenciales para comprender los factores que contribuyen al crecimiento y la progresión del tumor en un contexto in vivo. Aquí, se proporciona un protocolo en el que las células cancerosas se mezclan con fibroblastos y se introducen en ratones para desarrollar tumores. Los tamaños de los tumores a lo largo del tiempo y los pesos finales de los tumores se determinan y comparan entre los grupos. El protocolo descrito puede proporcionar más información sobre el papel funcional de los CAF en el crecimiento y la progresión del tumor.
Introduction
Dentro del microambiente tumoral, uno de los tipos celulares más prominentes es el fibroblasto asociado al cáncer (CAF)1. Estos fibroblastos asociados a carcinomas pueden desempeñar un papel supresor tumoral 2,3. Por ejemplo, los fibroblastos que expresan S100A secretan colágenos que pueden encapsular carcinógenos y proteger contra la formación de carcinoma4. Además, el agotamiento de miofibroblastos positivos para actina del músculo liso α liso (AME) en el cáncer de páncreas causa inmunosupresión y acelera la progresión del cáncer de páncreas2. Los CAF también pueden coevolucionar con las células cancerosas y promover la progresión tumoral 5,6,7,8. Los fibroblastos pueden sintetizar y secretar proteínas de la matriz extracelular que crean un ambiente promotor de tumores8. Estas proteínas de la matriz extracelular pueden causar rigidez mecánica del tejido, que se asocia con la progresión tumoral 9,10. La matriz extracelular depositada puede actuar como una barrera física que inhibe la infiltración inmune11. La deposición de la matriz por CAF también se ha asociado con la invasión tumoral, ya que se ha demostrado que la fibronectina generada por CAF promueve la invasión tumoral12. Los CAF promueven la angiogénesis y reclutan células inmunosupresoras para el microambiente tumoral mediante la secreción del factor de crecimiento transformante β (TGF-β), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), la interleucina-6 (IL-6) y el ligando 12 de quimiocina CXC (CXCL12)13,14,15. Debido a su papel central en la promoción del crecimiento tumoral, los fibroblastos asociados al cáncer son un objetivo emergente para la terapia contra el cáncer 6,16,17,18.
El siguiente protocolo describe un método para probar cómo los fibroblastos afectan el crecimiento de tumores en un modelo de ratón bien establecido y ampliamente utilizado de crecimiento tumoral. Con el fin de comprender la importancia de los fibroblastos en el microambiente tumoral, el protocolo estándar para la introducción de células cancerosas en ratones para controlar su crecimiento se modificó para incluir fibroblastos con la introducción de células cancerosas. Las células cancerosas se pueden introducir por vía subcutánea o intradérmica. La introducción intradérmica daría lugar a tumores que surgen de la piel misma. Los xenoinjertos en los que las células cancerosas y los fibroblastos son coinyectados en ratones representan una importante herramienta metodológica para diseccionar el papel de los fibroblastos, las subpoblaciones de fibroblastos y los factores proteicos en la capacidad de promover el crecimiento del cáncer 19,20,21. Se proporciona un protocolo detallado para la coinyección de células cancerosas y fibroblastos en ratones. Este método puede ser utilizado para comparar la presencia o ausencia de fibroblastos, para comparar fibroblastos de diferentes fuentes20, o para comparar fibroblastos con y sin expresión de proteínas específicas19. Después de que se introducen las células cancerosas y los fibroblastos, el tamaño del tumor se puede controlar con el tiempo. Al final de los experimentos, los tumores pueden ser diseccionados y pesados. Al monitorear el crecimiento tumoral a lo largo del tiempo, se puede diseccionar la importancia de diferentes factores.
Existen posibles enfoques alternativos para estudiar el papel de los fibroblastos en el crecimiento tumoral. Como ejemplo, hay modelos basados en Cre-loxed que proporcionan la eliminación de genes específicos del tejido con impulsores expresados preferentemente en fibroblastos. Tales enfoques también brindan oportunidades para investigar el papel de genes y vías específicas en fibroblastos para la progresión tumoral. En comparación con los enfoques basados en Cre-lox, el protocolo proporcionado representaría un enfoque significativamente más rápido para monitorear el papel de los fibroblastos porque el crecimiento tumoral se monitorizaría en unas pocas semanas. El enfoque proporcionado también es significativamente menos costoso porque no requiere generar y albergar colonias de ratones genéticamente modificados. El protocolo proporcionado se puede utilizar para probar rápidamente el efecto de la eliminación de diferentes genes utilizando shRNAs en lugar de necesitar desarrollar colonias de ratones. El enfoque proporcionado también es más flexible porque permitiría una comparación de diferentes números de fibroblastos, diferentes proporciones de células cancerosas y fibroblastos, derribo de diferentes genes e incluso comparación de fibroblastos de diferentes sitios de tejidos o especies. Un enfoque Cre-lox tendría la ventaja de que los fibroblastos están presentes dentro de los ratones en un contexto más fisiológico.
El protocolo reportado aquí sería valioso para los científicos que buscan monitorear los efectos de los fibroblastos en el crecimiento tumoral de manera rápida y rentable. Este protocolo es especialmente valioso para los científicos que investigan diferentes subconjuntos de fibroblastos o fibroblastos de diferentes fuentes sobre el crecimiento tumoral en el crecimiento tumoral. Si es importante que la iniciación del tumor ocurra en un contexto fisiológico, entonces se deben considerar modelos de ratón genéticamente modificados.
Hay varios enfoques posibles para realizar estos experimentos. Los ratones inmunocompetentes pueden usarse como huéspedes, lo que permitiría la investigación de las interacciones fibroblasto-célula inmune. Para los modelos de ratón inmunocompetentes, se deben inyectar células cancerosas de ratón y fibroblastos embrionarios de ratón (MEF). El uso de MEFs también permite al investigador aprovechar la amplia gama de cepas de ratones knockout para probar la presencia o ausencia de un gen de interés. Alternativamente, los ratones inmunodeficientes se pueden usar para probar el papel de los fibroblastos humanos en la promoción del crecimiento de tumores en ratones que se derivan de células cancerosas humanas. La introducción de las células cancerosas se puede realizar por vía subcutánea u ortotópica. Para el melanoma, como se describe a continuación, la mezcla de tumor y fibroblastos se puede inyectar por vía intradérmica para una inyección ortotópica que simula más de cerca la ubicación dentro de la piel donde se desarrollaría un melanoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el experimento de la Figura 1, la cointroducción de fibroblastos dérmicos humanos con células de melanoma A2058 humanas dio lugar a tumores más grandes que cuando las células de melanoma se introdujeron sin fibroblastos coinyectados. Esta diferencia podría detectarse fácilmente en función del volumen y el peso del tumor. Los resultados son consistentes con múltiples informes de que los fibroblastos asociados al cáncer pueden promover el crecimiento tumora…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a todos los miembros del laboratorio Coller por sus útiles aportaciones. H.A.C. fue el becario Milton E. Cassel de la Fundación Rita Allen. Reconocemos NIH/NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, Premio Científico del Equipo de la Alianza de Investigación del Melanoma, Premio del Programa de Integración de Laboratorios Clínicos del Instituto de Investigación del Cáncer, el Centro de Salud de la Mujer Iris Cantor/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, Comité Coordinador de Investigación del Cáncer de la Universidad de California, Premio Temático del Metabolismo de la Escuela de Medicina David Geffen, el Instituto de Ciencia Traslacional Clínica y el Centro Oncológico Integral Jonsson, Premios a la innovación del Broad Stem Cell Research Center (Rose Hills y Ha Gaba), un premio del UCLA SPORE en cáncer de próstata (Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio P50CA092131), un Premio a la Innovación del Broad Stem Cell Center, el Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research en UCLA, el Programa de Capacitación en Biología de Células Tumorales (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), el Programa de Dermatología T32 en UCLA AR071307, y el Programa de Capacitación en Biología de Células Musculares, Fisiopatología y Terapéutica T32 de UCLA 5 T32 AF 65972.
Materials
| 26G Needles | Fisher Scientific | 14-826-10 | |
| Alcohol swabs | Fisher Scientific | 326895 | |
| Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 | WAHL Professional | 8787-450A | |
| Athymic nude mice (NU/J) | The Jackson labs | 002019 | These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced. |
| Cancer cells | ATCC | ATCC® CRL-11147™ | This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used. |
| Cell Culture Multi Flasks | Fisher Scientific | 14-826-95 | |
| Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Countess Cell Counting Chamber | Fisher Scientific | C10228 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | MT35010CV | |
| Fibroblasts | ATCC | PCS-201-012 | We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used. |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | NDC 11695-6776-2 | |
| PBS USP grade for injection into mice | Fisher Scientific | 50-751-7476 | |
| Sterile 10 ml serological pipet | Celltreat | 667210B | |
| Sterile 5 ml serological pipet | Celltreat | 229005B | |
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Genesee Scientific | 28-108 | |
| Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns | Fisher Scientific | 09-740-61A | |
| Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 15400054 | |
| Sterile tissue-culture grade PBS | Fisher Scientific | 50-751-7476 | |
| Sterle 25 ml serological pipet | Celltreat | 667225B | |
| TC treated 100 x 20 mm dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| TC treated 150 x 20 mm dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| TC treated 60 x 15 mm dishes | Genesee Scientific | 25-260 | |
| Trypan blue | Fisher Scientific | C10228 |
Riferimenti
- Liu, T., et al. Cancer-associated fibroblasts: an emerging target of anti-cancer immunotherapy. Journal of Hematology and Oncololgy. 12 (1), 86 (2019).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25 (6), 719-734 (2014).
- Rhim, A. D., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 25 (6), 735-747 (2014).
- Zhang, J., et al. Fibroblast-specific protein 1/S100A4-positive cells prevent carcinoma through collagen production and encapsulation of carcinogens. Ricerca sul cancro. 73 (9), 2770-2781 (2013).
- Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1503-1523 (2014).
- Chen, X., Song, E. Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).
- Wang, W., et al. Crosstalk to stromal fibroblasts induces resistance of lung cancer to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors. Clinical Cancer Research. 15 (21), 6630-6638 (2009).
- Hwang, R. F., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Ricerca sul cancro. 68 (3), 918-926 (2008).
- Tsujino, T., et al. Stromal myofibroblasts predict disease recurrence for colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 13 (7), 2082-2090 (2007).
- Laklai, H., et al. Genotype tunes pancreatic ductal adenocarcinoma tissue tension to induce matricellular fibrosis and tumor progression. Nature Medicine. 22 (5), 497-505 (2016).
- Cukierman, E., Bassi, D. E. Physico-mechanical aspects of extracellular matrix influences on tumorigenic behaviors. Seminars in Cancer Biology. 20 (3), 139-145 (2010).
- Attieh, Y., et al. Cancer-associated fibroblasts lead tumor invasion through integrin-beta3-dependent fibronectin assembly. Journal of Cell Biology. 216 (11), 3509-3520 (2017).
- Ahmadzadeh, M., Rosenberg, S. A. TGF-beta 1 attenuates the acquisition and expression of effector function by tumor antigen-specific human memory CD8 T cells. Journal of Immunology. 174 (9), 5215-5223 (2005).
- Feig, C., et al. Targeting CXCL12 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti-PD-L1 immunotherapy in pancreatic cancer. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 110 (50), 20212-20217 (2013).
- Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Ziani, L., Chouaib, S., Thiery, J. Alteration of the Antitumor Immune Response by Cancer-Associated Fibroblasts. Frontiers in Immunology. 9, 414 (2018).
- Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
- Grum-Schwensen, B., et al. Suppression of tumor development and metastasis formation in mice lacking the S100A4(mts1) gene. Ricerca sul cancro. 65 (9), 3772-3780 (2005).
- Kojima, M., et al. Human subperitoneal fibroblast and cancer cell interaction creates microenvironment that enhances tumor progression and metastasis. PLoS One. 9 (2), 88018 (2014).
- Noel, A., et al. Enhancement of tumorigenicity of human breast adenocarcinoma cells in nude mice by matrigel and fibroblasts. British Journal of Cancer. 68 (5), 909-915 (1993).
- Sullivan, L. M. Estimation from samples. Circulation. 114 (5), 445-449 (2006).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Damianova, R., Stefanova, N., Cukierman, E., Momchilova, A., Pankov, R. Three-dimensional matrix induces sustained activation of ERK1/2 via Src/Ras/Raf signaling pathway. Cell Biology International. 32 (2), 229-234 (2008).
- Rhee, S. Fibroblasts in three dimensional matrices: cell migration and matrix remodeling. Experimental & Molecular Medicine. 41 (12), 858-865 (2009).
- Hoffman, R. M. Application of GFP imaging in cancer. Labortatory Investigation. 95 (4), 432-452 (2015).
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
- Naito, Y., et al. CD8+ T cells infiltrated within cancer cell nests as a prognostic factor in human colorectal cancer. Ricerca sul cancro. 58 (16), 3491-3494 (1998).
- Fu, C., Jiang, A. Dendritic Cells and CD8 T Cell Immunity in Tumor Microenvironment. Frontiers Immunolofy. 9, 3059 (2018).
- Lakins, M. A., Ghorani, E., Munir, H., Martins, C. P., Shields, J. D. Cancer-associated fibroblasts induce antigen-specific deletion of CD8 (+) T Cells to protect tumour cells. Nature Communications. 9 (1), 948 (2018).
- Kato, T., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Affect Intratumoral CD8(+) and FoxP3(+) T Cells Via IL6 in the Tumor Microenvironment. Clinical Cancer Research. 24 (19), 4820-4833 (2018).
- Gorchs, L., et al. Human Pancreatic Carcinoma-Associated Fibroblasts Promote Expression of Co-inhibitory Markers on CD4(+) and CD8(+) T-Cells. Frontiers Immunology. 10, 847 (2019).
- Duscher, D., et al. Fibroblast-Specific Deletion of Hypoxia Inducible Factor-1 Critically Impairs Murine Cutaneous Neovascularization and Wound Healing. Plastic Reconstructive Surgery. 136 (5), 1004-1013 (2015).
- Zheng, B., Zhang, Z., Black, C. M., de Crombrugghe, B., Denton, C. P. Ligand-dependent genetic recombination in fibroblasts : a potentially powerful technique for investigating gene function in fibrosis. American Journal of Pathology. 160 (5), 1609-1617 (2002).
- Swonger, J. M., Liu, J. S., Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Genetic tools for identifying and manipulating fibroblasts in the mouse. Differentiation. 92 (3), 66-83 (2016).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
- Ortiz-Montero, P., Londono-Vallejo, A., Vernot, J. P. Senescence-associated IL-6 and IL-8 cytokines induce a self- and cross-reinforced senescence/inflammatory milieu strengthening tumorigenic capabilities in the MCF-7 breast cancer cell line. Cell Communication and Signaling. 15 (1), 17 (2017).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biolofy. 4 (3), 83 (2006).
- Mitra, M., et al. Alternative polyadenylation factors link cell cycle to migration. Genome Biolofy. 19 (1), 176 (2018).
- Lemons, J. M., et al. Quiescent fibroblasts exhibit high metabolic activity. PLoS Biology. 8 (10), 1000514 (2010).
- Suh, E. J., et al. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biology. 13 (12), 121 (2012).
- Legesse-Miller, A., et al. Quiescent fibroblasts are protected from proteasome inhibition-mediated toxicity. Molecular Biology of the Cell. 23 (18), 3566-3581 (2012).
- Evertts, A. G., et al. H4K20 methylation regulates quiescence and chromatin compaction. Molecular Biology of the Cell. 24 (19), 3025-3037 (2013).
- Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
- Marinkovic, A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Matrices of physiologic stiffness potently inactivate idiopathic pulmonary fibrosis fibroblasts. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 422-430 (2013).
- Tschumperlin, D. J. Fibroblasts and the ground they walk on. Physiology (Bethesda). 28 (6), 380-390 (2013).
- Tschumperlin, D. J., et al. Mechanotransduction through growth-factor shedding into the extracellular space. Nature. 429 (6987), 83-86 (2004).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
- Alexander, J., Cukierman, E. Stromal dynamic reciprocity in cancer: intricacies of fibroblastic-ECM interactions. Current Opinions in Cell Biology. 42, 80-93 (2016).
